Joint Molecule Formation During Recombination

摘要/摘要： -- 同源重组是一种重要的染色体修复过程，在减数分裂过程中起着至关重要的作用。 产生配子的特殊细胞分裂过程。减数分裂过程中的缺陷是导致配子分裂的主要原因。 人类有不孕不育、妊娠丢失和先天性心脏病等疾病。这是我们对减数分裂认识上的一个重大差距。 重组是重组相关DNA合成技术(RADS)的核心机制之一，而RADS是实现这一目标的关键技术。 恢复染色体的完整性。但这种知识和鸿沟仍然存在，因为许多固有的挑战涉及到对减数分裂的研究。 RADS在体内存在，特别是考虑到DNA和复制因子的基本性质，人们需要更多地孤立地研究RADS。 从染色体到复制，从特殊分析的要求到RADS的测量，这些障碍都有。 现在，我们已经通过使用一种创新的化学、实时检测和分子遗传学研究工具的组合来克服这些困难。 萌芽中的酵母菌能够使基本复制因子发生急性失活，特别是在重组过程中。 以及对DNA合成的新的测量方法。这个新的系统利用了一个简单的ATP模拟的敏感的等位基因。 在S阶段之后，但在重组过程尚未启动之前，需要将细胞同步化。 基本的复制因子的失活是通过使用生长素诱导的降解因子(AID)系统来实现的，该系统包括。 已经重新布线，并优化了细胞在减数分裂过程中使用的基因。为了更好地监测RADS，新合成的DNA片段被标记了。 分离并使用5-乙炔基-2‘-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)掺入，生物素-叠氮，点击化学，对其进行定量。 链霉亲和素的提纯和定量聚合酶链式反应(QPCR)。在利用这些工具的同时，实现了这一目标的长期目标。 项目负责人需要进一步了解RADS的性质、功能、运行机制和监管机制。这些目标将不会改变。 通过三个目标来追求这一目标。这一目标将决定RADS在减数分裂的主要DNA和事件中所起的重要作用。 利用世界上最全面的核型电池组进行减数分裂前期染色体事件的重组 分子、基因和细胞学分析在萌芽中的酵母中是独一无二的。Aim-2将测试各种型号的RADS。 通过勾勒出主要的复制因素，系统地分析了它们的主要作用，并进行了互补的研究。 在这个小鼠实验中，我们将进一步分析基因重组过程中不同部位的基因复制因素的本地化趋势和动态变化。 找出并表征在新的复制招聘过程中涉及的因素以及促进网站重组的因素。 我们将继续使用免疫荧光和细胞学技术来监测人类的染色体动力学。 复制和复制的因素决定了其进一步本地化的遗传基因要求。以及RADS的最佳时机和范围。 我们还将在突变株和突变株中分析预测可能影响RADS的因素，包括减数分裂特有的因素。 蛋白质、DNA解旋酶和拓扑异构酶的重组。这些目标的最终结果不会提供更多的信息。 我们对RADS的运行机制和监管体系有了前所未有的洞察力，填补了我们在对中国的全面理解方面的一个重大空白。 减数分裂和重组。这些发现将有助于理解与人类胚胎发育相关的病理变化。 人们预计减数分裂、分裂和分裂将进一步定义与染色体修复广泛相关的各种范式。

Summary/Abstract    Homologous recombination is a chromosome repair process that plays essential roles in meiosis, the  specialized cell division that produces gametes. Defects in meiotic recombination are a leading cause of  infertility, pregnancy loss and congenital disease in humans. A major gap in our understanding of meiotic  recombination is the mechanism of the recombination-­associated DNA synthesis (RADS) that is essential to  restore chromosome integrity. This knowledge gap persists because of inherent challenges to studying meiotic  RADS in vivo, in particular the essential nature of DNA replication factors, the need to study RADS in isolation  from chromosomal replication, and the requirement for special assays to measure RADS. These hurdles have  now been overcome using an innovative combination of chemical, real-­time and molecular genetics tools in  budding yeast that enable acute inactivation of essential replication factors specifically during recombination,  and measurement of de novo DNA synthesis. This system utilizes an ATP-­analog sensitive allele of the Cdc7  kinase (cdc7-­as3) to synchronize cells after S-­phase, but before recombination is initiated. Real-­time  inactivation of essential replication factors is achieved using the auxin-­inducible degron (AID) system, which  has been rewired and optimized for use in meiotic cells. To monitor RADS, newly synthesized DNA is labeled,  isolated and quantified using 5-­ethynyl-­2′-­deoxyuridine (Edu) incorporation, biotin-­azide click chemistry,  streptavidin purification and quantitative PCR (qPCR). Exploiting these tools, the long-­term objectives of this  project are to understand the nature, function, mechanism and regulation of RADS. These objectives will be  pursued through three aims. Aim 1 will determine the role of RADS for both the DNA events of meiotic  recombination and the chromosomal events of meiotic prophase using the comprehensive battery of  molecular, genetic and cytological assays uniquely available in budding yeast. Aim 2 will test models of RADS  by delineating the replication factors involved and systematically analyzing their roles. Complementary studies  in mouse will analyze the localization and dynamics of replication factors at sites of recombination. Aim 3 will  identify and characterize factors involved in the recruitment of replication factors to recombination sites and the  regulation of RADS. Immunofluorescence cytology will be used to monitor chromosomal dynamics of  replication factors and determine the genetic requirements for their localization. The timing and extent of RADS  will be analyzed in strains mutant for factors predicted to modulate RADS, including meiosis-­specific  recombination proteins, DNA helicases and topoisomerases. The results of these aims will provide  unprecedented insights into the mechanism and regulation of RADS, filling a major gap in our understanding of  meiotic recombination. These findings will be germane to understanding pathologies associated with human  meiosis, and are expected to define paradigms that are broadly relevant for chromosome repair.