Joint Molecule Formation During Recombination

摘要/摘要 同源重组是一种染色体修复过程，在减数分裂中起重要作用， 产生配子的特殊细胞分裂。减数分裂重组中的缺陷是导致 不孕症、流产和先天性疾病。我们对减数分裂的理解中的一个主要空白 重组是重组相关DNA合成（RADS）的机制， 恢复染色体的完整性。由于研究减数分裂的固有挑战，这种知识差距仍然存在 RADS在体内，特别是DNA复制的本质因子，需要单独研究RADS 从染色体复制，并需要特殊的测定来测量RADS。这些障碍 现在已经克服了使用化学，真实的-时间和分子遗传学工具的创新组合， 能够在重组过程中特异性地使必需复制因子急性失活的芽殖酵母， 和从头DNA合成的测量。该系统利用Cdc 7的ATP-ATP类似物敏感等位基因， 激酶（cdc 7-CD 33）在S-DNA期之后但在重组开始之前使细胞同步化。真实的-实时 使用生长素诱导降解决定子（AID）系统实现了必需复制因子的失活， 已经被重新连接和优化用于减数分裂细胞。为了监测RADS，新合成的DNA被标记， 使用5-β-乙炔基-β 2′-β-脱氧尿苷（Edu）掺入，生物素-β-叠氮点击化学， 链霉亲和素纯化和定量PCR（qPCR）。利用这些工具， 项目的目的是了解RADS的性质、功能、机制和规则。这些目标将 追求三个目标。目的1将确定RADS在减数分裂DNA事件中的作用， 重组和减数分裂前期的染色体事件使用的综合电池， 分子、遗传和细胞学分析在芽殖酵母中是唯一可用的。目标2将测试RADS模型 通过描述所涉及的复制因素并系统地分析它们的作用。补充研究 将分析复制因子在重组位点的定位和动力学。目标3将 鉴定和表征参与将复制因子募集到重组位点的因子， RADS的规则。免疫荧光细胞学将用于监测染色体动力学， 复制因子，并决定其定位的遗传要求。RADS的时间和范围 将在突变株中分析预测调节RADS的因素，包括减数分裂特异性 重组蛋白、DNA解旋酶和拓扑异构酶。这些目标的结果将提供 对RADS的机制和调节的前所未有的见解，填补了我们对 减数分裂重组这些发现将有助于理解与人类疾病相关的病理学。 减数分裂，并预计将定义广泛相关的染色体修复的范例。

Summary/Abstract    Homologous recombination is a chromosome repair process that plays essential roles in meiosis, the  specialized cell division that produces gametes. Defects in meiotic recombination are a leading cause of  infertility, pregnancy loss and congenital disease in humans. A major gap in our understanding of meiotic  recombination is the mechanism of the recombination-­associated DNA synthesis (RADS) that is essential to  restore chromosome integrity. This knowledge gap persists because of inherent challenges to studying meiotic  RADS in vivo, in particular the essential nature of DNA replication factors, the need to study RADS in isolation  from chromosomal replication, and the requirement for special assays to measure RADS. These hurdles have  now been overcome using an innovative combination of chemical, real-­time and molecular genetics tools in  budding yeast that enable acute inactivation of essential replication factors specifically during recombination,  and measurement of de novo DNA synthesis. This system utilizes an ATP-­analog sensitive allele of the Cdc7  kinase (cdc7-­as3) to synchronize cells after S-­phase, but before recombination is initiated. Real-­time  inactivation of essential replication factors is achieved using the auxin-­inducible degron (AID) system, which  has been rewired and optimized for use in meiotic cells. To monitor RADS, newly synthesized DNA is labeled,  isolated and quantified using 5-­ethynyl-­2′-­deoxyuridine (Edu) incorporation, biotin-­azide click chemistry,  streptavidin purification and quantitative PCR (qPCR). Exploiting these tools, the long-­term objectives of this  project are to understand the nature, function, mechanism and regulation of RADS. These objectives will be  pursued through three aims. Aim 1 will determine the role of RADS for both the DNA events of meiotic  recombination and the chromosomal events of meiotic prophase using the comprehensive battery of  molecular, genetic and cytological assays uniquely available in budding yeast. Aim 2 will test models of RADS  by delineating the replication factors involved and systematically analyzing their roles. Complementary studies  in mouse will analyze the localization and dynamics of replication factors at sites of recombination. Aim 3 will  identify and characterize factors involved in the recruitment of replication factors to recombination sites and the  regulation of RADS. Immunofluorescence cytology will be used to monitor chromosomal dynamics of  replication factors and determine the genetic requirements for their localization. The timing and extent of RADS  will be analyzed in strains mutant for factors predicted to modulate RADS, including meiosis-­specific  recombination proteins, DNA helicases and topoisomerases. The results of these aims will provide  unprecedented insights into the mechanism and regulation of RADS, filling a major gap in our understanding of  meiotic recombination. These findings will be germane to understanding pathologies associated with human  meiosis, and are expected to define paradigms that are broadly relevant for chromosome repair.