Joint Molecule Formation During Recombination

点击翻译按钮获取中文摘要

Summary/Abstract    Homologous recombination is a chromosome repair process that plays essential roles in meiosis, the  specialized cell division that produces gametes. Defects in meiotic recombination are a leading cause of  infertility, pregnancy loss and congenital disease in humans. A major gap in our understanding of meiotic  recombination is the mechanism of the recombination-­associated DNA synthesis (RADS) that is essential to  restore chromosome integrity. This knowledge gap persists because of inherent challenges to studying meiotic  RADS in vivo, in particular the essential nature of DNA replication factors, the need to study RADS in isolation  from chromosomal replication, and the requirement for special assays to measure RADS. These hurdles have  now been overcome using an innovative combination of chemical, real-­time and molecular genetics tools in  budding yeast that enable acute inactivation of essential replication factors specifically during recombination,  and measurement of de novo DNA synthesis. This system utilizes an ATP-­analog sensitive allele of the Cdc7  kinase (cdc7-­as3) to synchronize cells after S-­phase, but before recombination is initiated. Real-­time  inactivation of essential replication factors is achieved using the auxin-­inducible degron (AID) system, which  has been rewired and optimized for use in meiotic cells. To monitor RADS, newly synthesized DNA is labeled,  isolated and quantified using 5-­ethynyl-­2′-­deoxyuridine (Edu) incorporation, biotin-­azide click chemistry,  streptavidin purification and quantitative PCR (qPCR). Exploiting these tools, the long-­term objectives of this  project are to understand the nature, function, mechanism and regulation of RADS. These objectives will be  pursued through three aims. Aim 1 will determine the role of RADS for both the DNA events of meiotic  recombination and the chromosomal events of meiotic prophase using the comprehensive battery of  molecular, genetic and cytological assays uniquely available in budding yeast. Aim 2 will test models of RADS  by delineating the replication factors involved and systematically analyzing their roles. Complementary studies  in mouse will analyze the localization and dynamics of replication factors at sites of recombination. Aim 3 will  identify and characterize factors involved in the recruitment of replication factors to recombination sites and the  regulation of RADS. Immunofluorescence cytology will be used to monitor chromosomal dynamics of  replication factors and determine the genetic requirements for their localization. The timing and extent of RADS  will be analyzed in strains mutant for factors predicted to modulate RADS, including meiosis-­specific  recombination proteins, DNA helicases and topoisomerases. The results of these aims will provide  unprecedented insights into the mechanism and regulation of RADS, filling a major gap in our understanding of  meiotic recombination. These findings will be germane to understanding pathologies associated with human  meiosis, and are expected to define paradigms that are broadly relevant for chromosome repair.