Zebrafish Resource Core

斑马鱼资源核心

• 批准号: 10213224
• 负责人: LILIANNA SOLNICAKREZEL
• 金额: $ 8.96万
• 依托单位: WASHINGTON UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2018-09-15 至 2023-06-30
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10213224
• 关键词: Adult; Alleles; Animal Model; Animals; Antibodies; Bioinformatics; CRISPR/Cas technology; Caenorhabditis elegans; Cells; Code; Collection; Communities; DNA; Defect; Development; Diagnosis; Dideoxy Chain Termination DNA Sequencing; Disease; Disease model; Embryo; Embryonic Development; Evaluation; Exhibits; Experimental Models; Fertility; Fertilization; Fishes; Gene Expression; Generations; Genes; Genomic DNA; Genomics; Guide RNA; Human; Image; Injections; International; Invertebrates; Knock-in; Laboratories; Larva; Leadership; Maintenance; Methods; Microscopy; Modeling; Morphology; Mutation; Oligonucleotides; Optics; Organ; Organism; Orthologous Gene; Pathogenicity; Patients; Phenotype; Protein Sequence Analysis; Proteins; RNA; Reporting; Resources; Robotics; Scheme; Skeleton; Structure; Symptoms; Testing; Time; Tissues; Universities; Variant; Washington; Zebrafish; Zebrafish Proteins; base; deep sequencing; design; experimental study; feeding; gene product; genetic analysis; genetic variant; genome editing; homologous recombination; human disease; improved; in vivo; insertion/deletion mutation; interest; loss of function; male; mature animal; medical schools; microCT; mutant; mutation carrier; overexpression; rapid growth; reverse genetics; screening; soft tissue; spatiotemporal; sperm cell; transcription activator-like effector nucleases; transmission process; zebrafish development; zebrafish genome; zygote

The Zebrafish Resource Core (Zf-­Core) will be an integral component of the Washington University in St. Louis  School  of  Medicine  Model  Organism  Screening  Center  (wuMOSC),  a  multi-­model  organism  platform  for  functional  analysis  of  Undiagnosed  Diseases  Network  (UDN)  variants.  It  will  serve  as  a  resource  for  gene  variant modeling, particularly in cases where analysis is not feasible in invertebrate model organisms, such as  D.  melanogaster  and/or  C.  elegans.  We  anticipate  that  our  bioinformatic  analyses  will  designate  ~65  variants  per year to be analyzed in the zebrafish model.   We  will  leverage  the  relatively  short  generation  time,  high  fecundity,  and  external  development  of  transparent  zebrafish  embryos  to  develop  and  implement  a  rapid,  efficient,  and  disease  variant-­tailored  pipeline for evaluating the variant pathogenicity using CRISPR/Cas9 approaches and/or RNA overexpression.  The Zf-­Core has improved on previous methods of fish husbandry by employing large-­scale robotic feeding to  allow  for  rapid  growth  of  animals.  This  effectively  halves  the  typical  zebrafish  generation  time  and  thus  will  accelerate  screening  UDN  variants  proposed  here.  The  PI  laboratory  also  recently  improved  homologous  recombination-­based genome editing methods in zebrafish using TALEN or CRISPR/Cas9 strategies.    For UDN gene-­variants where the null allele manifests a phenotype prior to day 3 post fertilization, we will  assess  the  degree  to  which  the  mutant  phenotype  can  be  rescued  by  injection  into  one-­celled  zygotes  of  synthetic  RNA  encoding  the  human  protein  variant,  or  zebrafish  protein  with  this  variant  introduced.  These  experiments provide a rapid assessment as to whether the variant has normal, reduced, elevated or otherwise  abnormal  activity.  If  lines  harboring  nonsense  or  other  deleterious  mutations  in  the  disease  gene  of  interest  already  exist  they  will  be  imported  to  our  Zf-­Core.  Alternatively,  we  will  generate  small  insertions/deletions  (indel) mutations using CRISPR/Cas9 strategy by designing a guide RNA that would also allow us to introduce  the disease variant into the endogenous locus.   In a second strategy, for genes with phenotypes detectable after day 3 post fertilization, the variant will be  knocked-­into  the  zebrafish  ortholog  by  CRISPR/Cas9  editing.  The  phenotype  of  the  resulting  loss  of  function  and knock-­in mutants will be analyzed to verify any reported defects or to uncover them. Transparent embryos  and  larvae  will  be  evaluated  at  the  level  of  overall  morphology,  formation  of  specific  organs  and  tissues  using  in  vivo  microscopy,  and  adults  by  microCT  imaging  to  assess  skeleton  and  soft  tissues.  Observation  of  a  phenotype with a variant knock-­in suggests that the variant is deleterious to the model organism and provides  experimental  evidence  that  it  is  a  promising/likely  disease-­causing  candidate.  Lack  of  observable  phenotype  would  indicate  the  experimental  test  provides  no  evidence  for  pathogenicity.  The  Zf-­  Core  will  be  a  strong  component of the wuMOSC to inform the diagnosis of rare and poorly characterized diseases.

斑马鱼资源和核心项目(ZF-Core)将成为圣路易斯市华盛顿国际大学项目的一个重要组成部分。 中国医学院生物模型生物筛选研究中心(WuMOSC)，一个为中国提供的全球多模式生物筛选平台。 对未诊断的人类疾病和网络疾病(UDN)及其变异体的功能分析。它将成为该基因的重要资源库。 变异生物建模，特别是在分析方法不太可行的情况下，对无脊椎动物和生物的模型进行建模，例如。 我们预计，在我们的生物信息学分析中，我们将不会指定大约65个变种。 每年都需要在全球斑马鱼模型中对其进行分析。 我们将利用中国相对较短的世代时间、较高的繁殖力和较高的外部经济发展速度。 透明的斑马鱼胚胎需要更多的开发，并实施一种快速、高效、疾病和疾病的变种-量身定做。 通过使用CRISPR/Cas9方法和/或RNAs过表达来评估新的变异体的致病性。 新的ZF-Core项目通过使用大规模的机器人饲养机来改进以前的养鱼和养殖业的传统方法。 允许动物的快速生长。这将有效地减少典型的斑马鱼世代的一半，因此它将继续存在。 这里建议加快对UDN基因变种的筛选。中国的PI基因实验室最近也发现了改进的同源基因。 在斑马鱼中，基于重组的基因组编辑方法是使用TTALEN策略或CRISPR/Cas9策略。 对于UDN基因变异体，如果在受精后3天之前，大多数无效等位基因表现为不同的表型，我们将继续努力。 评估在何种程度上可以通过向猪的单细胞受精卵中注射DNA来挽救主要突变体的表型。 我们介绍了一种编码人类主要蛋白质变异体的合成核糖核酸，即编码斑马鱼蛋白质的新变异体。 实验将提供一种快速的数据评估方法，以确定数据的变体数据是正常的、减少的、还是升高的。 异常的基因活动。如果有一些品系含有无稽之谈或其他有害的基因突变，那么他们感兴趣的疾病和基因突变就会发生。 它们已经存在，它们将不会被导入以支持我们的ZF--Core。或者，我们将不会生成一些小的插入/删除。 (Indel)通过使用CRISPR/Cas9的策略来防止突变，方法是设计一种新的RNA指南，该指南也将允许我们进一步介绍。 这种疾病的变异体进入了新的内源性基因座。 在第二个新战略中，对于表型不同的基因，在受精后第三天可以检测到的基因，将不会被检测到。 由CRISPR/Cas9编辑的斑马鱼同源基因。这是导致其功能丧失的主要表型基因。 此外，还将对敲入基因的突变体进行分析，以进一步核实是否有任何报告的基因缺陷或缺陷，以帮助发现这些缺陷。 此外，还将从整体形态、特定器官的形成过程和组织的使用情况等方面对幼虫进行全面的评价。 在活体显微镜下，儿童和成人通过显微CT和成像技术对骨骼和软组织进行评估。 表型与一种新的变种和敲入基因一起表明，新的变种对破坏提供的生物模型和基因是有害的。 有实验证据表明，它是一个很有希望/可能致病的候选基因。它缺乏可观察到的基因表型。 这将表明，新的试验性细菌检测没有提供任何新的致病性证据。但新的ZF-5核心细菌将不会是一个强大的基因。 该委员会的组成部分负责将罕见疾病和特征不佳的疾病的最新诊断结果通报给他们。