Zebrafish Resource Core

点击翻译按钮获取中文摘要

The Zebrafish Resource Core (Zf-­Core) will be an integral component of the Washington University in St. Louis  School  of  Medicine  Model  Organism  Screening  Center  (wuMOSC),  a  multi-­model  organism  platform  for  functional  analysis  of  Undiagnosed  Diseases  Network  (UDN)  variants.  It  will  serve  as  a  resource  for  gene  variant modeling, particularly in cases where analysis is not feasible in invertebrate model organisms, such as  D.  melanogaster  and/or  C.  elegans.  We  anticipate  that  our  bioinformatic  analyses  will  designate  ~65  variants  per year to be analyzed in the zebrafish model.   We  will  leverage  the  relatively  short  generation  time,  high  fecundity,  and  external  development  of  transparent  zebrafish  embryos  to  develop  and  implement  a  rapid,  efficient,  and  disease  variant-­tailored  pipeline for evaluating the variant pathogenicity using CRISPR/Cas9 approaches and/or RNA overexpression.  The Zf-­Core has improved on previous methods of fish husbandry by employing large-­scale robotic feeding to  allow  for  rapid  growth  of  animals.  This  effectively  halves  the  typical  zebrafish  generation  time  and  thus  will  accelerate  screening  UDN  variants  proposed  here.  The  PI  laboratory  also  recently  improved  homologous  recombination-­based genome editing methods in zebrafish using TALEN or CRISPR/Cas9 strategies.    For UDN gene-­variants where the null allele manifests a phenotype prior to day 3 post fertilization, we will  assess  the  degree  to  which  the  mutant  phenotype  can  be  rescued  by  injection  into  one-­celled  zygotes  of  synthetic  RNA  encoding  the  human  protein  variant,  or  zebrafish  protein  with  this  variant  introduced.  These  experiments provide a rapid assessment as to whether the variant has normal, reduced, elevated or otherwise  abnormal  activity.  If  lines  harboring  nonsense  or  other  deleterious  mutations  in  the  disease  gene  of  interest  already  exist  they  will  be  imported  to  our  Zf-­Core.  Alternatively,  we  will  generate  small  insertions/deletions  (indel) mutations using CRISPR/Cas9 strategy by designing a guide RNA that would also allow us to introduce  the disease variant into the endogenous locus.   In a second strategy, for genes with phenotypes detectable after day 3 post fertilization, the variant will be  knocked-­into  the  zebrafish  ortholog  by  CRISPR/Cas9  editing.  The  phenotype  of  the  resulting  loss  of  function  and knock-­in mutants will be analyzed to verify any reported defects or to uncover them. Transparent embryos  and  larvae  will  be  evaluated  at  the  level  of  overall  morphology,  formation  of  specific  organs  and  tissues  using  in  vivo  microscopy,  and  adults  by  microCT  imaging  to  assess  skeleton  and  soft  tissues.  Observation  of  a  phenotype with a variant knock-­in suggests that the variant is deleterious to the model organism and provides  experimental  evidence  that  it  is  a  promising/likely  disease-­causing  candidate.  Lack  of  observable  phenotype  would  indicate  the  experimental  test  provides  no  evidence  for  pathogenicity.  The  Zf-­  Core  will  be  a  strong  component of the wuMOSC to inform the diagnosis of rare and poorly characterized diseases.