Zebrafish Resource Core

斑马鱼资源核心（Zf-ZfCore）将成为圣路易斯华盛顿大学的一个组成部分 医学院模式生物筛选中心（wuMOSC），一个多学科模式生物平台， 未诊断疾病网络（UDN）变体的功能分析。 它将作为基因资源， 变异建模，特别是在无脊椎动物模式生物中分析不可行的情况下，例如 D. melanogaster和/或C. 优雅 我们预计，我们的生物信息学分析将指定约65个变体 在斑马鱼模型中进行分析。 我们将利用相对较短的世代时间，高繁殖力和外部发展， 透明的斑马鱼胚胎开发和实施快速，高效，和疾病的变异-量身定制 使用CRISPR/Cas9方法和/或RNA过表达评估变体致病性的管道。 Zf-1000 Core改进了以前的养鱼方法，采用大规模机器人喂食， 让动物快速成长。 这有效地将典型的斑马鱼世代时间减半， 加速筛选UDN变体。 PI实验室最近还改进了同源 使用TALEN或CRISPR/Cas9策略在斑马鱼中进行基于重组的基因组编辑方法。 对于其中无效等位基因在受精后第3天之前表现出表型的UDN基因突变体，我们将 评估在何种程度上突变表型可以通过注射到单细胞受精卵中来挽救。 编码人蛋白变体的合成RNA，或引入该变体的斑马鱼蛋白。 这些 实验提供了关于该变体是否具有正常、降低、升高或其它性质的快速评估 异常活动 如果在感兴趣的疾病基因中含有无义突变或其他有害突变， 已经存在的，它们将被导入到我们的Zf-Core。 或者，我们将生成小的插入/删除 使用CRISPR/Cas9策略，通过设计一种指导RNA， 将疾病变异导入内源基因座。 在第二种策略中，对于受精后第3天后可检测到表型的基因，变体将是 通过CRISPR/Cas9编辑敲入斑马鱼直系同源物。 导致功能丧失的表型 和敲除蛋白突变体将被分析以验证任何报告的缺陷或揭示它们。透明胚 和幼虫将在整体形态学水平上进行评估，特定器官和组织的形成， 体内显微镜检查，成人通过microCT成像评估骨骼和软组织。 观察一个 具有变体敲除蛋白的表型表明该变体对模式生物是有害的， 实验证据表明它是一种有希望的/可能的致病候选物。 缺乏可观察的表型 表明实验测试没有提供致病性的证据。 Zf-100核心将是一个强大的 wuMOSC的组成部分，以告知罕见和特征不明确的疾病的诊断。

The Zebrafish Resource Core (Zf-­Core) will be an integral component of the Washington University in St. Louis  School  of  Medicine  Model  Organism  Screening  Center  (wuMOSC),  a  multi-­model  organism  platform  for  functional  analysis  of  Undiagnosed  Diseases  Network  (UDN)  variants.  It  will  serve  as  a  resource  for  gene  variant modeling, particularly in cases where analysis is not feasible in invertebrate model organisms, such as  D.  melanogaster  and/or  C.  elegans.  We  anticipate  that  our  bioinformatic  analyses  will  designate  ~65  variants  per year to be analyzed in the zebrafish model.   We  will  leverage  the  relatively  short  generation  time,  high  fecundity,  and  external  development  of  transparent  zebrafish  embryos  to  develop  and  implement  a  rapid,  efficient,  and  disease  variant-­tailored  pipeline for evaluating the variant pathogenicity using CRISPR/Cas9 approaches and/or RNA overexpression.  The Zf-­Core has improved on previous methods of fish husbandry by employing large-­scale robotic feeding to  allow  for  rapid  growth  of  animals.  This  effectively  halves  the  typical  zebrafish  generation  time  and  thus  will  accelerate  screening  UDN  variants  proposed  here.  The  PI  laboratory  also  recently  improved  homologous  recombination-­based genome editing methods in zebrafish using TALEN or CRISPR/Cas9 strategies.    For UDN gene-­variants where the null allele manifests a phenotype prior to day 3 post fertilization, we will  assess  the  degree  to  which  the  mutant  phenotype  can  be  rescued  by  injection  into  one-­celled  zygotes  of  synthetic  RNA  encoding  the  human  protein  variant,  or  zebrafish  protein  with  this  variant  introduced.  These  experiments provide a rapid assessment as to whether the variant has normal, reduced, elevated or otherwise  abnormal  activity.  If  lines  harboring  nonsense  or  other  deleterious  mutations  in  the  disease  gene  of  interest  already  exist  they  will  be  imported  to  our  Zf-­Core.  Alternatively,  we  will  generate  small  insertions/deletions  (indel) mutations using CRISPR/Cas9 strategy by designing a guide RNA that would also allow us to introduce  the disease variant into the endogenous locus.   In a second strategy, for genes with phenotypes detectable after day 3 post fertilization, the variant will be  knocked-­into  the  zebrafish  ortholog  by  CRISPR/Cas9  editing.  The  phenotype  of  the  resulting  loss  of  function  and knock-­in mutants will be analyzed to verify any reported defects or to uncover them. Transparent embryos  and  larvae  will  be  evaluated  at  the  level  of  overall  morphology,  formation  of  specific  organs  and  tissues  using  in  vivo  microscopy,  and  adults  by  microCT  imaging  to  assess  skeleton  and  soft  tissues.  Observation  of  a  phenotype with a variant knock-­in suggests that the variant is deleterious to the model organism and provides  experimental  evidence  that  it  is  a  promising/likely  disease-­causing  candidate.  Lack  of  observable  phenotype  would  indicate  the  experimental  test  provides  no  evidence  for  pathogenicity.  The  Zf-­  Core  will  be  a  strong  component of the wuMOSC to inform the diagnosis of rare and poorly characterized diseases.