Impaired Astroglial Glutamate Signaling in Rett Syndrome

摘要 Rett综合征（RTT）是导致女性严重智力残疾的主要原因。RTT患者的发展 通常直到6- 18个月，当自闭症-类自闭症行为以及有目的的手部使用和言语缺陷时， 开始发展。X染色体连锁转录调节因子甲基化CpG结合蛋白的功能缺失突变 2（MECP 2）发生在>95%的RTT病例中。最初，神经元中的MeCP 2缺乏被认为是唯一的 RTT的原因，但最近的研究表明，缺乏功能性MeCP 2的神经胶质细胞也有显着的 RTT病因学中的病理作用。然而，神经胶质细胞功能障碍的具体细胞机制， 作用或其行为后果尚未确定。 在这项研究中，我们建议检查 一种特殊的神经胶质细胞亚型--星形胶质细胞对纹状体功能障碍的作用 在用于RTT的基于Mecp 2-β的小鼠模型中。 星形胶质细胞表达编码谷氨酸的Slc 1a 2基因 转运蛋白-EAAT 1（GLT-EAAT 1，也称为EAAT 2）在调节细胞外谷氨酸水平中具有关键作用。我们提出 在条件性基因敲除（cKO）小鼠中， 使用实验方法的组合，包括全星形胶质细胞， 纹状体切片的细胞内记录和光遗传学，细胞内Ca 2+的时间推移成像， 细胞外谷氨酸和多巴胺，近红外超分辨率共聚焦显微镜，定量行为 使用机器学习分类器进行评估。 我们的初步结果表明， 组成型Mecp 2 KO小鼠纹状体中的Slc 1a 2，与较小的GLT-β 1-γ介导的细胞内Na+一致 信号和膜电流。 有趣的是，Mecp 2 cKO小鼠表现出更高的运动能力， 在开放领域的测试。 我们还提供了初步证据，证明GLT-β 1在调节 细胞外谷氨酸水平，星形胶质细胞的细胞内Ca 2+动力学，以及多巴胺的释放， 多巴胺能末梢 基于先前的工作和这些初步结果，我们假设星形胶质细胞 纹状体中的谷氨酸信号传导在Mecp 2缺陷小鼠中受损，并导致它们的运动缺陷。 我们提出了两个具体的目标：（1）识别和表征GLT-101的细胞后果 在星形胶质细胞中缺乏Mecp 2的cKO小鼠中的功能障碍，和（2）表征神经元网络活性， 星形胶质细胞中缺乏Mecp 2的cKO小鼠的纹状体-纹状体相关行为。 拟议的研究将阐明 星形胶质细胞GLT-1功能中MeCP 2缺失对纹状体依赖性行为的影响， 不仅对RTT而且对与纹状体功能障碍相关的其他脑部疾病具有广泛的意义。

ABSTRACT  Rett syndrome (RTT) is a leading cause of severe intellectual disability in women. Individuals with RTT develop  typically  until  6-­18  months,  when  autism-­like  behaviors  as  well  as  deficits  in  purposeful  hand  use  and  speech  start to develop. Loss-­of-­function mutations in the X-­linked transcriptional regulator methyl-­CpG-­binding protein   2 (MECP2) occur in >95% of RTT cases. Initially, MeCP2 deficiency in neurons was considered as the exclusive  cause of RTT, but recent studies have revealed that glial cells lacking functional MeCP2 also have a significant  pathological role in RTT etiology. However, specific cellular mechanisms of glial cell dysfunction underlying this  role  or  its  behavioral  consequences  have  not  been  identified.  In  this  study,  we  propose  to  examine  the  contribution of a specific glial subtype, astrocytes, to the dysfunction of the striatum responsible for motor deficits  in  a  Mecp2-­based  mouse  model  for  RTT.  Astrocytes  expressing  the  Slc1a2  gene  encoding  glutamate  transporter-­1 (GLT-­1, also EAAT2) have a pivotal role in regulating extracellular glutamate levels. We propose  to characterize the contribution of GLT-­1 dysfunction to glutamate signaling in conditional knockout (cKO) mice  lacking  Mecp2  only  in  astrocytes  using  a  combination  of  experimental  approaches,  including  whole-­cell  intracellular  recordings  and  optogenetics  in  striatal  slices,  time-­lapse  imaging  of  intracellular  Ca2+  and  extracellular glutamate and dopamine, near-­super resolution confocal microscopy, and quantitative behavioral  assessments  using  machine-­learning  classifiers.  Our  preliminary  results  indicate  lower  expression  levels  of  Slc1a2 in the striatum of constitutive Mecp2 KO mice, consistent with smaller GLT-­1-­mediated intracellular Na+  signals  and  membrane  currents  in  striatal  astrocytes.  Intriguingly,  Mecp2  cKO  mice  show  higher  locomotor  activity  in  the  open  field  test.  We  also  present  preliminary  evidence  of  the  role  of  GLT-­1  in  modulating  extracellular  glutamate  levels,  intracellular  Ca2+  dynamics  in  astrocytes,  and  dopamine  release  from  dopaminergic  terminals.  Based  on  prior  work  and  these  preliminary  results,  we  hypothesize  that  astroglial  glutamate  signaling  in  the  striatum  is  impaired  in  Mecp2  deficient  mice  and  contributes  to  their  motor  deficits.  We  propose  two  Specific  Aims:  (1)  Identify  and  characterize  the  cellular  consequences  of  GLT-­1  dysfunction in cKO mice lacking Mecp2 in astrocytes, and (2) Characterize neuronal network activity and  striatum-­related  behaviors  in  cKO  mice  lacking Mecp2  in  astrocytes.  The  proposed  studies  will  elucidate  the consequences of MeCP2 loss in astrocyte GLT-­1 function on striatum-­dependent behaviors, which will have  broad implications not only for RTT but also for other brain disorders associated with striatal dysfunction.