Impaired Astroglial Glutamate Signaling in Rett Syndrome

摘要： 视网膜色素变性综合征(RTT)是导致女性严重智力障碍的主要原因之一。 通常会持续到6-18个月，当他们有自闭症样的行为以及有缺陷的人有目的地使用语言和演讲时。 开始开发。功能丧失和突变发生在与CpG结合的甲基CpG结合蛋白中。 2MECP2可以发生在95%的RTT病例中。最初，MeCP2在神经元中的缺陷被认为是唯一的。 这是RTT的原因，但最近的研究发现，神经胶质细胞缺乏功能基因MeCP2也具有显著意义。 病理改变在RTT的病因学中起重要作用。然而，胶质细胞功能障碍的特定细胞调控机制是潜在的原因。 其角色或行为后果尚未完全确定。在这项研究中，我们将提出对其进行全面审查的建议。 星形胶质细胞是一种特殊的神经胶质细胞亚型，它与纹状体的神经功能障碍有关，是运动功能障碍的罪魁祸首。 在一个基于MeCP2的小鼠模型中，研究了RTT。星形胶质细胞表达编码谷氨酸的第二个SLc1a2基因。 Transporter-1(GLT-1，也称为EAAT2)在调节细胞外谷氨酸水平方面发挥了至关重要的作用。 为了更好地表征GLT-1功能障碍的主要贡献因素，我们发现在条件性基因敲除障碍(CKO)小鼠中，谷氨酸和信号转导机制是相互作用的。 缺乏MeCP2只能在星形胶质细胞中发挥作用，而使用一系列实验方法的组合，包括全细胞方法。 细胞内钙离子的记录和纹状体切片中的光遗传学研究，以及细胞内钙离子和钙离子的延时成像。 细胞外谷氨酸和多巴胺，近超分辨率的共聚焦显微镜，扫描和定量的行为。 评估正在使用机器学习和分类器。但我们的初步测试结果表明，他们的表达水平较低。 Slc1a2在MeCP2和KO小鼠的纹状体内表达，与较小的GLT-1介导的细胞内Na+的表达一致。 信号和细胞膜电流分布在纹状体和星形胶质细胞中。有趣的是，MeCP2和CKO组小鼠表现出更高的运动性。 我们还将提供初步的证据，证明GLT-1在细胞调节中发挥了重要作用。 星形胶质细胞的细胞外谷氨酸水平、细胞内钙离子浓度、细胞内钙离子浓度和多巴胺从细胞内释放的量。 多巴胺能神经末梢。根据先前的工作和这些初步的研究结果，我们可以假设星形胶质细胞。 在MeCP2缺陷的小鼠中，纹状体中的谷氨酸信号转导蛋白受到损害，这有助于改善他们的大脑运动功能缺陷。 我们将提出两个具体的目标：(1)确定并描述GLT-1的主要细胞毒性后果。 CKO小鼠出现功能障碍，星形胶质细胞缺乏MeCP2基因(2)可以表征神经元网络的活性。 CKO小鼠的纹状体相关行为与星形胶质细胞中缺乏MeCP2基因有关。这项拟议的研究将不会澄清。 MeCP2的主要后果是星形胶质细胞GLT-1功能的丧失取决于纹状体依赖的行为，而纹状体依赖的行为将不会发生。 广泛的影响不仅适用于RTT，也适用于其他与纹状体功能障碍相关的脑部疾病。

ABSTRACT  Rett syndrome (RTT) is a leading cause of severe intellectual disability in women. Individuals with RTT develop  typically  until  6-­18  months,  when  autism-­like  behaviors  as  well  as  deficits  in  purposeful  hand  use  and  speech  start to develop. Loss-­of-­function mutations in the X-­linked transcriptional regulator methyl-­CpG-­binding protein   2 (MECP2) occur in >95% of RTT cases. Initially, MeCP2 deficiency in neurons was considered as the exclusive  cause of RTT, but recent studies have revealed that glial cells lacking functional MeCP2 also have a significant  pathological role in RTT etiology. However, specific cellular mechanisms of glial cell dysfunction underlying this  role  or  its  behavioral  consequences  have  not  been  identified.  In  this  study,  we  propose  to  examine  the  contribution of a specific glial subtype, astrocytes, to the dysfunction of the striatum responsible for motor deficits  in  a  Mecp2-­based  mouse  model  for  RTT.  Astrocytes  expressing  the  Slc1a2  gene  encoding  glutamate  transporter-­1 (GLT-­1, also EAAT2) have a pivotal role in regulating extracellular glutamate levels. We propose  to characterize the contribution of GLT-­1 dysfunction to glutamate signaling in conditional knockout (cKO) mice  lacking  Mecp2  only  in  astrocytes  using  a  combination  of  experimental  approaches,  including  whole-­cell  intracellular  recordings  and  optogenetics  in  striatal  slices,  time-­lapse  imaging  of  intracellular  Ca2+  and  extracellular glutamate and dopamine, near-­super resolution confocal microscopy, and quantitative behavioral  assessments  using  machine-­learning  classifiers.  Our  preliminary  results  indicate  lower  expression  levels  of  Slc1a2 in the striatum of constitutive Mecp2 KO mice, consistent with smaller GLT-­1-­mediated intracellular Na+  signals  and  membrane  currents  in  striatal  astrocytes.  Intriguingly,  Mecp2  cKO  mice  show  higher  locomotor  activity  in  the  open  field  test.  We  also  present  preliminary  evidence  of  the  role  of  GLT-­1  in  modulating  extracellular  glutamate  levels,  intracellular  Ca2+  dynamics  in  astrocytes,  and  dopamine  release  from  dopaminergic  terminals.  Based  on  prior  work  and  these  preliminary  results,  we  hypothesize  that  astroglial  glutamate  signaling  in  the  striatum  is  impaired  in  Mecp2  deficient  mice  and  contributes  to  their  motor  deficits.  We  propose  two  Specific  Aims:  (1)  Identify  and  characterize  the  cellular  consequences  of  GLT-­1  dysfunction in cKO mice lacking Mecp2 in astrocytes, and (2) Characterize neuronal network activity and  striatum-­related  behaviors  in  cKO  mice  lacking Mecp2  in  astrocytes.  The  proposed  studies  will  elucidate  the consequences of MeCP2 loss in astrocyte GLT-­1 function on striatum-­dependent behaviors, which will have  broad implications not only for RTT but also for other brain disorders associated with striatal dysfunction.