Live cell affinity receptor chromatography (LARC)
活细胞亲和受体层析 (LARC)
基本信息
- 批准号:298426-2009
- 负责人:
- 金额:$ 2.19万
- 依托单位:
- 依托单位国家:加拿大
- 项目类别:Discovery Grants Program - Individual
- 财政年份:2013
- 资助国家:加拿大
- 起止时间:2013-01-01 至 2014-12-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
Cell surface receptors are a key group of proteins targeted by drugs for the treatment of disease. Cell surface receptors may bind proteins or other target molecules that carry messages to the cell. There has been a concerted, but largely unsuccessful, effort to find a way to directly isolate and analyze the proteins in receptor complexes since the middle of the last century. I propose to create a method to directly capture a receptor complex from the surface of live cells by fixing their binding target onto microscopic beads. I will use a protein from blood to capture its receptor complex from the surface of living white blood cells. Human white blood cells have receptors that bind to germs to engulf and destroy them. Antibodies for bacterial recognition may be attached to microscopic beads. The beads will be used to capture the receptor complex for engulfing germs from the surface of the white blood cells. The microbeads carrying the receptor beads will be collected and the receptor proteins captured will be identified by mass spectrometry. Different types of salts and detergents as well as enzymes will be used to remove common cellular material such as DNA, RNA or ribosomes that tend to stick to beads. The optimal type of bead, size of bead, chemical method of attachment to the bead, and time for collecting the beads will be determined. The best methods for extracting the receptor proteins and to fractionate them using chromatography prior to identification will be determined. The proteins can be identified by breaking them into pieces with enzymes, and separating them followed by mass spectrometry and computer searching using classical mathematics. Proteins identified from extracted receptor complexes will be confirmed with a laser microscope by independent methods such as the use of specific antibodies and green fluorescence tagging. The method will elucidate the proteins required by the receptor complex for engulfing germs. More importantly, our success would mean that Canada will have a general method for isolating receptor complexes directly from the surface of live cells. This will permit the identification and validation of new and specific drug targets for the treatment of many diseases.
细胞表面受体是治疗疾病的药物靶向的一组关键蛋白质。 细胞表面受体可以结合蛋白质或其他将信息传递给细胞的靶分子。自上个世纪中期以来,人们一直在努力寻找一种直接分离和分析受体复合物中蛋白质的方法,但基本上没有成功。 我建议创建一种方法,通过将它们的结合靶固定在微观珠上,直接从活细胞表面捕获受体复合物。 我将用血液中的一种蛋白质从活的白色血细胞表面捕获它的受体复合物。 人类的白色血细胞有一种受体,可以与细菌结合,吞噬并消灭细菌。 用于细菌识别的抗体可以附着于微观珠粒。 这些珠子将用于捕获受体复合物,以从白色血细胞表面吞噬细菌。 将收集携带受体珠的微珠,并通过质谱法鉴定捕获的受体蛋白。 不同类型的盐和洗涤剂以及酶将用于去除常见的细胞物质,如DNA,RNA或核糖体,这些物质往往会粘在珠子上。 将确定微珠的最佳类型、微珠的尺寸、微珠附着的化学方法和收集微珠的时间。 将确定用于提取受体蛋白并在鉴定前使用色谱法对其进行分离的最佳方法。 这些蛋白质可以通过酶将它们分解成碎片,然后通过质谱法和使用经典数学的计算机搜索将它们分离出来。 从提取的受体复合物中鉴定的蛋白质将通过独立的方法(例如使用特异性抗体和绿色荧光标记)用激光显微镜进行确认。 该方法将阐明吞噬细菌的受体复合物所需的蛋白质。 更重要的是,我们的成功将意味着加拿大将拥有直接从活细胞表面分离受体复合物的通用方法。 这将允许识别和验证用于治疗许多疾病的新的和特定的药物靶点。
项目成果
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