Structural Biology of Miz-1 and of C2H2 Zinc Fingers

在本研究项目中，我们的目标是阐明多趾基C2H2锌指转录因子mz -1的结构生物学。我们将重点研究mz -1与细胞周期抑制剂p15INK4b （p15）和p21CIP1 （p21）的核心启动子之间的相互作用。mz -1直接与这些核心启动子结合并激活p15和p21的转录。人类基因组中编码多趾酰基C2H2 ZF蛋白的基因超过700个，平均每个基因有8个。C2H2 zf是一种小的模块结构域（约30个残基），已知参与基因启动子中DNA碱基的三联体识别。另一方面，越来越多的证据表明，C2H2 ZFs也参与蛋白质之间的相互作用。有一个关于多趾型ZF转录因子功能的新范式，这意味着ZF的亚群参与DNA结合，其他亚群参与蛋白质-蛋白质相互作用。mz -1具有13个C2H2 ZFs一致序列，并且根据这一新范式，已经表明其前4个ZFs可以与Smad3结合，从而促进p15和p21的转录激活。另一方面，目前尚不清楚哪些zf与p15和p21核心启动子结合。在这种情况下，使用dna酶I足迹、电泳迁移率转移测定、核磁共振、等温滴定量热法和原子力显微镜等技术，我们建议确定：1- 13个mz -1 ZFs中哪一个与p15和p21核心启动子特异性相互作用，2- ZFs 1至4和11至13（我们已经解决了5-10）以及同源ZF/DNA复合物的NMR溶液结构，3-阐明ZFs 1至4与Smad3之间的相互作用模式，4-研究mz -1结合对p15和p21核心启动子拓扑结构的影响。该研究项目将对mz -1和C2H2 ZF的结构生物学产生重大影响，并有助于验证多dactyl C2H2 ZF TFs功能的新机制。它还将为我们理解p15和p21的转录调控提供重要的新视角，p15和p21是细胞周期中最重要的两个基因。#(cr)#(lf) C2H2型的转录因子plusieurs doigts de Zinc （DZ）的转录因子编程de recherche porte sur la biologie strucale de la liaison sp<s:1> cifique <e:1> l'ADN par miz1。Nous noous concentrerons sur l'interaction entre miz1和les promoators proximaux des g<e:1> p15INK4b （p15）和p21CIP1 （p21）。mz -1，在p15和p21的转录中具有活性。加上de 700 g<s:1> codent pour des factors de transcription <e:1> DZ C2H2倍数（en moyenne 8 par g<e:1>）。ldz de type C2H2发送了de petits domaines proprosamiques （~30 rsamsiques）的分类，并重新定义了lleur的联络spsamcifique conl 'ADN。在生物学结构、功能、转录因子等方面，我们发现了一种全新的遗传模式。因此，根据提议，DZ总干事干事与DZ总干事之间的联系是：DZ总干事与DZ总干事之间的联系是：DZ总干事与DZ总干事plutôt之间的联系是：DZ总干事与DZ总干事之间的联系是：DZ总干事与DZ总干事之间的联系。Miz-1大陆13 samsamons consensus pour des DZ C2H2。根据平均范例，4个总理DZ - dmi -1与Smad3之间存在着相互矛盾。在p15和p21转录的激活过程中，相互作用非常重要。D'un autre côté，现在有新的研究表明，DZ是一种相互作用的方法，而DZ是一种相互作用的方法，它可以促进p15和p21。在ce contexte et des方法现在实验运输,la共振Magnetique远离洛杉矶Atomique Microscopie一个力,la滴定Calorimetrique Isotherme, les凝胶阻碍(EMSA)常识proposons: 1 -德决定因素紧密相连DZ苏尔Miz-1 interagissent用l 'ADN des地区promotrices De p15 p21, 2 - De resoudre la结构RMN des DZ 1一4等11 13(而我们记忆resolu les结构des DZ 5一10)et des复合物specifiques用l 'ADN, 3 - D 'elucider le模式

In this research program, we aim to contribute to the elucidation of the structural biology the polydactyl C2H2 Zinc Finger Transcription Factor Miz-1. We will focus on the interaction between Miz-1 and the core promoters of the cell cycle inhibitors p15INK4b (p15) and p21CIP1 (p21). Miz-1 binds directly to these core promoters and activates the transcription of p15 and p21. More than 700 genes code for polydactyl C2H2 ZF proteins in the human genome with an average of 8 per gene. C2H2 ZFs are small modular domains (~30 residues) known to be involved in the recognition of triplets of DNA bases in gene promoters. On the other hand, there is an increasing body of evidence demonstrating that C2H2 ZFs are also involved in protein-protein interactions. There is an emerging paradigm for the function of polydactyl ZF transcription factors, which implies that subsets of ZFs are involved in DNA binding and others are involved in protein-protein interaction. Miz-1 possesses 13 C2H2 ZFs consensus sequences and in accordance with this new paradigm, it has been show that its first 4 ZFs can bind to Smad3 to contribute in the activation of the transcription of p15 and p21. On the other hand, it is not known which ZFs bind to the p15 and p21 core promoters. In this context and using techniques such as Dnase I footprinting, Electrophoretic Mobility Shift Assays, Nuclear Magnetic Resonance, Isothermal Titration Calorimetry and Atomic Force Microscopy, we propose to determine: 1- Which of the 13 Miz-1 ZFs interact specifically with the p15 and p21 core promoters, 2- The NMR solution structure of ZFs 1 to 4 and 11 to 13 (we have already solved 5-10) and of the cognate ZF/DNA complexes, 3- Elucidate the mode of interaction between ZFs 1 to 4 and Smad3 and 4- investigate of the effect of the binding of Miz-1 on the topology of the p15 and p21 core promoters. This research program will have a significant impact on the structural biology of Miz-1 and C2H2 ZF in general and contribute to validate of a new mechanism for the function of polydactyl C2H2 ZF TFs. It will also shed crucial new light into our understanding of the transcriptional regulation of p15 and p21, arguably, two of the most important genes in the cell cycle.#(cr)#(lf)Cette programmation de recherche porte sur la biologie structurale de la liaison spécifique à l'ADN par Miz-1, un facteur de transcription contenant plusieurs doigts de Zinc (DZ) de type C2H2. Nous nous concentrerons sur l'interaction entre Miz-1 et les promoteurs proximaux des gènes p15INK4b (p15) et p21CIP1 (p21). Miz-1, lie directement ces promoteurs et active la transcription de p15 et p21. Plus de 700 gènes codent pour des facteurs de transcription à DZ C2H2 multiples (en moyenne 8 par gène). Les DZ de type C2H2 sont de petits domaines protéiques (~30 résidus) classiquement reconnu pour leur liaison spécifique à l'ADN. Cependant, un nouveau paradigme se dessine pour la biologie structurale et la fonction de ces facteurs de transcription. En effet, on propose que des sous-ensemble de DZ seraient spécialisés dans la liaison à l'ADN tandis que d'autres seraient plutôt aptes à lier d'autres protéines. Miz-1 contient 13 séquences consensus pour des DZ C2H2. En accord avec le paradigme émergent, les 4 premiers DZ de Miz-1 interagissent avec Smad3. Cette interaction est importante pour l'activation de la transcription de p15 et p21. D'un autre côté, nous ne savons pas quels sont les DZ qui interagissent avec l'ADN promotrice de p15 et p21. Dans ce contexte et en utilisant des approches expérimentales tels que la Résonance Magnétique Nucléaire, la Microscopie à Force Atomique, la Titration Calorimétrique Isotherme, les gels retards (EMSA) nous proposons: 1- De déterminer quels DZ sur Miz-1 interagissent avec l'ADN des régions promotrices de p15 et p21, 2- De résoudre la structure RMN des DZ 1 à 4 et 11 à 13 (nous avons déjà résolu les structures des DZ 5 à 10) et des complexes spécifiques avec l'ADN, 3- D'élucider le mode