SVP及下游信号miR172在柑橘一年多次成花中的作用和机制

前期研究发现早实枳与普通枳不同，在当年萌发形成的春梢上可以开二次花。本研究对一、二次花形成关键时期基因表达检测发现，SVP表达量变化与花形成吻合，原位杂交表明，顶端分生组织在向花分生组织转变时，其内SVP表达下调，转变完成后又恢复上调。进一步分析表明，二次花形成过程中，与SVP下调对应，下游miR172的表达上调。对SVP互作蛋白及其上下游调控基因的酵母单、双杂交研究表明，SVP存在多个互作对象，既可以与FLC的关键转录本FLCv5互作，进一步与下游靶基因AGL24和SOC1启动子结合，也可与SOC1和AP1基因直接互作调控成花。对具二次花形成能力的早实枳和不具二次花形成能力的普通枳在自剪前后小RNA测序分析发现，microRNA组分占有较高的比例。从中检索到141条已知的miRNAs和发现75条可能的新miRNA。种间保守的miRNAs在早实枳或普通枳都可检测到，但新的miRNAs的特异性很强，仅在早实枳或普通枳中发现，并且表达水平较低，推测可能参与特异代谢过程的调控。75条新的miRNAs中有51条预测到了靶基因，总共得到了317个潜在的靶基因。大多数miRNAs都存在着多个靶位点，并且还有多个miRNAs共同靶定同一个靶基因。对这些靶基因分析发现其中转录因子占较大比例，除了发育调控，还参与了防御响应、组蛋白调控及其它代谢过程。对miR156或miR172表达模式鉴定分析表明，虽然它们均参与了早实枳的成花转变，但前者随着年龄时期变化，表达逐渐降低，可能与阶段发育调控有关；而后者随着顶芽自剪，呈现周期性变化，与成花关系更为直接。对柑橘不同种属miR172不同成员的进化分析发现，早实枳miR172-03和miR172-12与一年多次开花的四季橘来源的miR172关系更密切，可能与多次成花调控有关。进一步采取人工控水促进四季橘二次开花，分析发现，中度控水可有效促发二次花，同时控水使SVP表达下调，miR172表达升高，与其成花数量密切相关，表明SVP和miR172确实参与了四季橘的二次成花调控。将miR172用农杆菌介导法转入烟草，获得阳性转化植株，表型分析证明，超表达miR172-12可有效促进转基因植株提早成花，且其雌蕊较雄蕊先熟。miR172超表达枳转化植株由于嵌合现象在后期生长过程中逐渐湮没，未观察到转基因表型，后续转化苗在进一步观察中。