鼠肝炎模型Th17中关键转录因子RORγt相互作用蛋白的鉴定和功能分析

本研究拟建立并鉴定 RORγt-Tags Knock-in小鼠，从小鼠淋巴细胞中分选Th17细胞；TAP方法纯化该细胞中RORγt蛋白复合体；质谱鉴定筛选所得的相互作用蛋白，Western Blot和 IP验证结果；生物信息学分析所获 RORγt相互作用蛋白，再利用激动剂、抑制剂、过表达或RNAi等方法进一步在细胞和动物水平研究各伙伴蛋白在正常或MHV感染状况下的功能。.按计划，我们已在美国专业转基因小鼠制备公司建立了该转基因小鼠（详细资料可以访问网站 https://client.genetargeting.com）。经鉴定，该小鼠转基因完全正确。我们分别在基因组水平，对插入基因的GFP基因、Neo基因等进行了鉴定，并通过子代交配，产生RORC KI纯合子小鼠。我们进一步在蛋白水平对转基因小鼠进行了鉴定，发现插入金银的RORγt-TAP融合蛋白正确表达、SBP (tag)正确表达。因此，我们最终获得了能正确表达插入基因的转基因小鼠，可以用于后续实验。然后我们利用FACS分选出高纯度KI小鼠CD4+GFP+Th17细胞（纯度>98%）。同时，我们也尝试将FACS分选的Th17细胞体外扩增后再进行质谱分析，以及采用美国NIH陈万军教授实验室的方案，在Th17细胞计划条件下，从naive CD4+T细胞中分化出高比例Th17细胞。最后，本课题组张轶博士在美国NIH赵可吉教授实验室进行约两年的科研研究期间，其和赵可吉教授共同创立一种研究蛋白质相互作用的新方法，即ReMTH-Seq （相关结果已投稿Nature Biotechnology, 在审）。因此，我们进一步尝试用该方法探寻RORc相互作用蛋白。本法基于Protein-fragment complementation assay和二代高通量测序方法，可在较短时间内获得高保真率的RORC相互作用蛋白。目前建立相关文库，正在进行双质粒转染，用FACS分选GFP阳性细胞，然后送测序。初步实验结果显示已经得到足够数量的GFP阳性细胞，正在送华大基因测序，相关结果可在近期产生并撰写高质量学术论文、投稿发表。