丙型肝炎病毒（HCV）入侵是病毒感染的首要环节，其包膜糖蛋白（E1、E2）与病毒新一轮感染密切相关。因组氨酸（His）的质子化状态变化接近于病毒融合阈值（~pH6），被认为在低pH依赖的HCV感染中起关键作用。本课题通过氨基酸序列比对，结合E2蛋白结构特点，选取了三个关键部位的保守组氨酸位点（H421，H490和H621）。采用遗传突变方法，构建了含His点突变的亚克隆质粒和全长质粒，体外转录出全长的野生型和各突变型病毒RNA，通过电穿孔的方法，将其分别导入HCV易感细胞Huh7.5.1细胞，发现各突变与野生型病毒具有相似的电穿效率。H421A突变体的病毒滴度、RNA复制和蛋白表达水平均稍高于野生型病毒，而H490A和H621A突变体均低于野生型病毒，尤其是H621A上清无明显感染性。由于Huh7.5.1细胞支持感染性病毒颗粒的再次感染，故用不表达CD81分子的Huh7细胞来研究各突变对单周期病毒复制、感染性的影响。发现H421A突变体的感染性比野生型高1~2倍，H490A突变体比野生型低约15倍，而H621A突变体未检测出感染性。对电穿后P1/6d细胞内HCV RNA和病毒蛋白（core和NS3）的表达情况进行检测，发现H421A突变的病毒RNA拷贝数和蛋白表达高于野生型，而H490A和H621A突变均与野生型类似或稍低；H421A突变体的特异感染性稍高于野生型，H490A突变体比野生型低3倍，提示H421A突变体能增强病毒复制和蛋白表达，但不影响子代病毒的入侵能力；H490A和H621A突变体虽不影响病毒复制与蛋白表达，但均能显著降低子代病毒的感染性，说明这两个组氨酸残基影响的是病毒入侵过程。进一步构建了含点突变的HCV E2蛋白重组表达质粒，并在细胞中表达；利用原核表达纯化的CD81大胞外环（LEL）蛋白检测野生型和突变型E2蛋白与CD81的结合活性。发现与野生型E2蛋白的CD81结合活性相比，H490A-E2蛋白的CD81结合活性下降，而H621A-E2蛋白的CD81结合活性极低或甚至完全丧失，这也与上述感染表型的结果相符。综上，本课题从HCV E2包膜蛋白中鉴定出了三个关键且保守的组氨酸残基，阐明了它们在整个病毒生活周期中的生物学功能及其影响机制，尤其是H490和H621在CD81介导的HCV入侵过程中发挥了重要作用，为病毒入侵抑制剂的研发提供了新靶点。