苹果中膜结合态多酚氧化酶纯化、表征及褐变机理研究

PPO is located in the thylakoid lumen of chloroplasts in two forms: membrane-bound (mPPO) and soluble (sPPO). mPPO is either weakly or strongly bound to the thylakoid membrane under normal condition and contributes to a percentage of 90% in total PPO. Even though the role of mPPO in plant tissue is not well understood, it has been hypothesized that mPPO can be easily activated, thereby contributing to browning and rotting. Few studies have focused on the effect or structure of mPPO in apples. This research is focused on the separation and purification of mPPO from two kinds of apples (Fuji and Granny Smith) to deal with their constructions and properties. Purification, characterization, property and active center of mPPO and browning mechanism of mPPO from apple will be studied. Thus to figure out the mechanism of enzymatic browning and the role of mPPO in this progress. This study will gain a better understanding of the behavior of mPPO in apples, thus enable a proper procedure for the PPO inactivation to be developed. In conclusion, this study would have been a theory basis for new study in enzymatic browning control and contribute to the fruit juice development of apples.

苹果中90%左右的多酚氧化酶以结合态形式存在。在正常状态下，细胞内的多酚氧化酶与质体、线粒体和细胞内膜结合，活性很低，但当细胞膜受到损伤后，潜在的多酚氧化酶被激活，从而导致果蔬制品的褐变量。随着研究的深入，发现膜结合态多酚氧化酶对苹果鲜榨汁酶促褐变的影响非常重要。但膜结合态多酚氧化酶的性质、结构及褐变机理尚未开展深入系统的研究。本项目对苹果中膜结合态多酚氧化酶进行分离纯化，进行结构表征和特性研究。对两个苹果品种膜结合态多酚氧化酶酶学性质的研究及结构的模拟、表征。分析其与底物结合的活性中心结构，从分子水平上探讨酶促褐变的机理，探索膜结合态多酚氧化酶在酶促褐变中的作用机制，以期为控制酶促褐变新方法的开发提供理论依据，为我国高品质鲜榨苹果汁产品的开发奠定基础。

褐变一直是制约苹果深加工的关键因素，已成为影响苹果加工的主要原因。多酚氧化酶（PPO）是导致苹果酶促褐变的关键酶，有研究表明PPO 可分为游离态和结合态，众多水果中PPO 主要以结合状态存在，如苹果中可溶态只占8%~15%。在正常状态下，细胞内的PPO与质体、线粒体和细胞内膜结合，活性很低，但当细胞膜受到损伤后，潜在的PPO 被激活，从而导致果蔬制品的褐变量。本文选取富士和澳洲青苹这两个品种为研究对象，分离纯化膜结合态多酚氧化酶，进行结构表征和特性研究，以期为控制酶促褐变新方法的开发提供理论依据。.通过柱层析分离澳洲青苹膜结合态多酚氧化酶，电泳结果显示mPPO为分子量65kDa的单体蛋白。经过质谱分析和Uniprot数据库比对查询，得出的mPPO的匹配蛋白为苹果属（Malus domestica）的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase IVa），序列号为I1U4K5，匹配度分值为79.25，序列相似性为28.28%.mPPO最适pH为7.0，最适温度为35℃和70℃，说明mPPO结构中可能存在不同的活性区域。mPPO最适底物是4-甲基儿茶酚，抗坏血酸和L-半胱氨酸对mPPO的抑制效果最佳，EDTA在抑制剂浓度达到50mM时对mPPO有明显的激活作用。低浓度的SDS对PPO有激活作用，说明纯化的mPPO在植物体内以潜在的形式存在。.通过圆二色谱和荧光光谱分析，mPPO是以 -螺旋为主的典型蛋白质且Trp残基部分位于非极性的疏水环境中。DLS结果表明mPPO在溶液状态下的粒径在5-10nm之间，透射电子显微镜显示mPPO分散性好且结构完整，蛋白分子近似球形。.利用同源建模建立的澳洲青苹和富士mPPO是以螺旋结构为主的蛋白质，活性中心主要位于由铜离子催化中心的氨基酸组成的疏水口袋中，且位于蛋白质表面，活性中心的每三个组氨酸残基与一个铜离子形成氢键。.以邻苯二酚为底物时，抗坏血酸、L-半胱氨酸和柠檬酸对澳洲青苹mPPO的抑制类型为竞争性抑制，谷胱甘肽为反竞争抑制，EDTA为非竞争性抑制。两种苹果mPPO的紫外光谱结果表明，酶活随着抑制剂浓度的增加出现了不同的平台延迟期。荧光猝灭类型主要是静态猝灭过程，其中抗坏血酸的猝灭能力最强。

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