针对持留和耐药结核分枝杆菌的双靶点药物筛选方法的建立和应用

摘要.结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis，Mtb）是人类肺结核（TB）的病原体。肺结核是一种严重威胁人类健康的传染病，在全球范围内每年造成多达三百万人死亡。AIDS的蔓延和多重耐药菌株（MDR）的出现使肺结核的防控形势异常严峻，传统药物已不能满足需要。因此，必须加紧新型抗结核药物的研发。.结核分枝杆菌基因组共编码11种STPKs。病原菌利用蛋白激酶和磷酸酶催化一些蛋白的磷酸化和去磷酸化，不仅可以调控许多细胞内新陈代谢的过程，同时也可干扰被感染宿主细胞的信号通路，在生理和毒力方面起着重要作用。结核分枝杆菌的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与人的同类激酶的同源性很低（＜30%），因此可作为研发新的抗结核抗生素的一类新的靶点。比较基因组学和基因组转座突变实验表明PknA, PknB 和 PknG是结核分枝杆菌在体内或体外生长所必须的，而其它大多数STPKs则调控细菌的一些非必须的生理过程。本项目选择PknB和PknG为靶点用来作为解决耐药以及持留结核分枝杆菌的问题突破点之一。.本项目克隆、表达和纯化PknB的N端激酶结构域、全酶以及PknG全酶，并分别以其为靶酶建立并优化了用于筛选化合物和发酵液的结核分枝杆菌激酶抑制剂高通量筛选模型，并利用所建立的PknB模型筛选了化合物样品18000个和2880个发酵液粗提样品，得到8个阳性化合物，其中3个化合物对包括结核分枝杆菌在内的多种分枝杆菌具有抑制作用，尤其是化合物YH-8具有抗结核分枝杆菌临床多重耐药株的活性，其MIC均为0.125μg/ml，且与异烟肼和利福平不产生交叉耐药。利用所建立的PknG筛选模型，从 6820 个发酵液样品和4300个化合物中筛得到阳性发酵液样品 14 个以及阳性化合物2个，其中1个发酵液样品对胞内分枝杆菌的生长具有明显的抑制活性，值得进一步深入的研究。.本研究还初步评价了阳性化合物和发酵液的抑酶活性、抑菌活性以及选择性毒性。在快速生长耻垢分枝杆菌中共表达PknG和GFP重组蛋白，并感染人单核巨噬细胞系THP-1，初步建立了快速评价阳性样品对胞内微生物抑制作用的测定方法。为深入研究这些样品阳性的作用机制和开发其潜在应用价值打下基础。