抗NRP-1b1/b2单克隆抗体抗肿瘤活性与机理研究

NRP-1是一个多功能受体，在肿瘤新生血管形成与肿瘤细胞迁移、黏附和侵袭等方面起非常重要调控作用，是一个很有希望的肿瘤治疗新靶标。本项目研究靶向NRP-1b1b2结构域的功能性抗体及其抗肿瘤作用的分子机制。RT-PCR从胃癌BGC-823细胞株中获取NRP-1b1b2基因， NRP-1b1b2-pET22b(+)重组载体表达于E.coli Rosetta细胞，纯化的NRP-1b1b2融合蛋白作为免疫原。细胞融合技术建立抗NRP-1b1b2单克隆抗体杂交瘤库，ELISA筛选获取一株能选择性阻断VEGF165结合NRP-1的功能性抗体（A6），ELISA、Western blot、co-IP和IHC结果显示A6可特异、高亲和力地结合rhuNRP-1b1b2；同时，也能捕获野生型NRP-1，并可用于肿瘤组织细胞NRP-1的定位与定量检测。竞争ELISA和Dot-ELISA分析显示NRP-1b1b2肽段不能抑制A6与NRP-1b1b2蛋白结合，提示A6结合位点不是NRP-1b1b2抗原的线性表位，而是构象表位。. 大鼠角膜新生血管模型实验显示A6对新生血管的生成具有抑制作用，并呈量效和时效关系。抗肿瘤活性实验证明A6对胶质瘤U87、胃癌BGC-823、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480细胞株的生长、迁移、侵袭均有显著抑制作用；动物人移植瘤模型治疗实验显示A6能抑制胶质瘤和胃癌裸鼠移植瘤的生长。生长抑制与凋亡实验证明A6可诱导SW480细胞凋亡、阻滞细胞周期于S期。Western blot揭示A6处理后SW480细胞的Bax、caspase-3蛋白表达上调，Bcl-2、PI3K(85)、p-Akt表达下调。结果表明A6对SW480的生长抑制与凋亡作用与下调PI3K/Akt信号通路相关。细胞粘附实验证明A6对MCF-7的粘附有显著抑制作用，共聚焦荧光显微镜观察和Western blot发现A6抗体能抑制粘附的MCF-7细胞应力纤维的重排、抑制NRP-1与整合素α5β1形成复合物、下调FAK、p130cas和Erk1/2的磷酸化水平。实验结果表明A6对MCF7粘附的抑制与其阻断α5β1-NRP-1/FAK/p130cas的信号通路有关。. 本项目研究结果阐明了靶向NRP-1b1b2抗体的抗肿瘤活性与分子机制，也为新靶标NRP-1的抗体药物发展提供了新思路。