发展，应用19F-标记的非天然氨基酸和核磁共振方法研究大分子量蛋白质在不同功能状态下的结构与功能关系

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31170817
项目类别：
面上项目
资助金额：
60.0万
负责人：
田长麟
依托单位：
中国科学技术大学
学科分类：
C0509.生物学过程与代谢
结题年份：
2015
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
吴芳明；石攀；李冬；史朝为；赖超华；
关键词：
非天然氨基酸在细胞结构研究动力学研究核磁共振大分子量蛋白质

项目摘要

近年来，越来越多的蛋白质三维结构获得了解析，我们能清楚了解这些蛋白质的重要活性位点或调节、影响蛋白质活性的关键氨基酸。为了进一步理解这些重要蛋白质在生命活动中的分子机制，我们有必要了解他们在不同功能状态下的结构变化和动力学特性。核磁共振方法在回答蛋白质的动力学特性方面具有比其他结构生物学方法较为优越的特性，能直接获得不同时间尺度下的动力学信息。但是，通常而言的核磁共振方法只能研究分子量较小的蛋白质（< 30 kDa）。为了解决这一问题，我们将应用19F-标记的非天然氨基酸实现蛋白质的定点标记，并在此基础上我们将发展，应用19F-核磁共振方法研究大分子量蛋白质（包括蛋白质复合物和膜蛋白）关键区域的结构变化、动力学特性、研究膜蛋白的亲水/疏水界面以及测量氨基酸之间的距离等，特别是在细胞状态下的蛋白质研究，为进一步理解蛋白质的分子机制和结构变化提供基本的研究数据。

结项摘要

本项目的研究内容为，应用19F-标记的非天然氨基酸实现蛋白质的定点同位素标记，并应用核磁共振方法研究大分子量蛋白质、蛋白质复合物或膜蛋白在不同功能状态下的结构与功能.关系。在本项目的支持下，按照项目研究计划，我们实现了应用19F对重水（D2O）的敏感性鉴定19F定点标记膜蛋白中的亲水/疏水区域。通过对大肠杆菌二酰基甘油激酶DAGK进行19F定点标记，分析了DAGK处于亲水loop、疏水螺旋以及亲疏水交界处的氨基酸残基的亲疏水性。位于膜蛋白不同位置的氨基酸残基溶剂暴露程度不同，19F 位点特异性氨基酸标记可用于研究膜蛋白的拓扑结构和残基的入膜深度。另外，通过发展19F定点标记方法，对大肠杆菌二酰基甘油激酶DAGK进行了原位核磁共振研究，进行了DAGK在去污剂以及原位膜环境下的化学位移和弛豫分析。位于膜蛋白不同位置的氨基酸残基的化学位移和纵向弛豫受不同膜环境的影响不同。为在天然膜环境下，研究膜蛋白的结构和动力学提供了新的思路。.在本项目的支持下，通过发展19F定点标记方法实现了对大肠杆菌酪氨酸激酶磷酸的定点磷酸化分析，为有效的定量研究磷酸化提供了新的思路。另外，依托本项目，应用定点标记我们发展了19F PRE实验对L27tan蛋白两种可能构象的分析表明L27tan在溶液中采取关闭构象。此方法能够应用于蛋白质中两点间距离的测量，尤其对复合物和膜蛋白的距离分析上具有重要意义。以上相关内容均已发表。.依托本项目，共培养了两名博士研究生，一名硕士研究生和多名本科生。