乙酰化/去乙酰化修饰调控ATG4B活性的分子机制及其在HCC细胞自噬与存活中的作用研究

Autophagy related 4B (ATG4B) is a key protein in the regulation of autophagy in mammalian cells, and it is closely related with hepatocellular carcinoma (HCC). Acetylation/deacetylation plays important roles in regulating the activities of proteins. However, it is unknown at present whether acetylation/deacetylation is involved in the regulation of ATG4B activity. Our pilot investigation demonstrated that the elevation of ATG4B activity (but not its protein level) promoted the autophagy and survival of HCC cells under starvation. Furthermore, we for the first time showed that the change of acetylation level may be an essential factor for manipulating ATG4B activity. Based on the innovative findings, we hypothesize that lysine acetyltransferase may decrease the activity of ATG4B and suppress the autophagy and survival of HCC cells by catalyzing ATG4B acetylation, while the deacetylase SIRT1-induced deacetylation of ATG4B may enhance the autophagy and survival of HCC cells through increasing ATG4B activity. In the present project, we will carry out a series of studies around this hypothesis in order to illustrate the detailed molecular mechanisms by which acetylation/deacetylation regulates ATG4B activity. Furthermore, we will clarify that the above molecular mechanisms are important ways to influence the autophagy and survival of HCC cells. The expected results of this project may provide scientific evidences for exploring and designing novel anti-HCC strategies by targeting ATG4B and its acetylation/deacetylation.

自噬相关蛋白ATG4B是哺乳类细胞自噬调节的关键蛋白，其与肝细胞癌（HCC）密切相关。乙酰化/去乙酰化修饰是蛋白质活性调节的重要方式，但其是否参与调节ATG4B的活性，目前尚未见报道。我们通过前期探索，证实ATG4B活性（而非其蛋白水平）的升高促进了饥饿条件下HCC细胞的自噬与存活，进而首次发现乙酰化水平的变化可能是调节ATG4B活性的重要因素。据此提出如下假设：赖氨酸乙酰转移酶可能通过催化ATG4B的乙酰化修饰而降低ATG4B的活性，从而抑制HCC细胞的自噬与存活；而去乙酰化酶SIRT1诱导的ATG4B去乙酰化则可能通过升高ATG4B的活性而促进HCC细胞的自噬与存活。本项目将围绕该假设开展一系列研究，以期率先揭示乙酰化/去乙酰化修饰调控ATG4B活性的具体分子机制，明确相关机制是影响HCC细胞自噬与存活的重要方式，为探索和设计以ATG4B及其乙酰化/去乙酰化修饰为靶标的抗HCC新策略提供科学依据。

自噬相关蛋白ATG4B是哺乳类细胞自噬调节的关键蛋白，其与肝细胞癌（HCC）细胞的自噬与存活密切相关。乙酰化/去乙酰化修饰是蛋白质活性调节的重要方式，但其是否参与调节ATG4B的活性，目前未见报道。因此，阐明乙酰化/去乙酰化修饰调控ATG4B活性的具体分子机制及其在HCC细胞自噬与存活中的作用，对于探索以ATG4B及其乙酰化/去乙酰化修饰为靶标的抗HCC新策略具有重要意义。在本项目中，我们发现ATG4B的去乙酰化在饥饿诱导的自噬中发挥了重要作用。机制研究显示，在饥饿状态下，HCC细胞中cyclin E水平下调，使得游离CDK2增多（即CDK2-cyclin E复合体减少），从而使CDK2活性降低，进而使去乙酰化酶SIRT2的磷酸化水平下降，SIRT2活性升高；同时，饥饿可使乙酰转移酶p300水平降低。SIRT2活性升高和p300水平降低，均可导致ATG4B的乙酰化水平下降，其活性升高，从而增强保护性自噬，促进HCC细胞的存活与生长。进一步研究发现，SIRT2催化ATG4B去乙酰化和p300催化ATG4B乙酰化的位点均为K39位点。以上发现揭示了一条ATG4B乙酰化/去乙酰化依赖的自噬调控新机制，为探索以ATG4B及其乙酰化/去乙酰化修饰为靶标的抗HCC新策略提供了科学依据，同时也为设计模拟或干预SIRT2（或p300）与ATG4B之间相互作用的有效措施奠定了实验基础。.此外，我们还发现：①lncRNA CRNDE可通过吸附和下调miR-543而增强ATG4B mRNA的稳定性，从而升高ATG4B蛋白的水平，进而促进保护性自噬，降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性。该结果提示抑制“CRNDE/ATG4B/自噬”通路可能增强索拉非尼对HCC细胞的杀伤效应。②核受体LXR可通过上调miR-124-3p而降低cyclin D1和CDK6的表达水平，从而抑制HCC细胞的存活与生长；③二氯乙酸盐可增强索拉非尼杀伤HCC细胞的效应。机制研究显示，二者联用可显著升高HCC细胞中ROS的水平，继而激活JNK，促进抗凋亡蛋白Mcl-1的磷酸化，从而加速Mcl-1降解，促进HCC细胞凋亡；④左旋棉酚可通过下调抗凋亡蛋白Survivin而增强表柔比星对HCC细胞的杀伤效应，从而为探索增敏表柔比星抗HCC的新措施提供了科学依据。.基于以上有关研究结果，已发表SCI论文6篇、会议论文2篇。

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