EB病毒LMP2特异性结合affibody分子的筛选及特性研究

Epstein-Barr virus (EBV) infection is very wide and is closely related to the pathogenesis of tumors such as nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. Till to now, there is no specific approach to combating EBV infection and its related tumors.Molecular targeted therapies based on monoclonal antibody is the most promising new way for tumor therapy. However, the problems such as its side effects, poor stability and in vivo clearance quickly limited its wider application. Affibody molecules derived from staphylococcal protein A (SPA), has the characteristics of high affinity bingding with specific protein molecules, and also has strong penetrating, good stability and easy to prepare. Therfore, there are more advantages than monoclonal antibodies in cancer targeting therapy. In this study, we intend to screen the EBV LMP2 specific affibody molecules by using genetic engineering and phage display technology, and prepare the specific affibody molecules recombinant protein with bacterial toxins (affitoxin), to test and verify its specific binding and targeting to nasopharyngeal cancer cells in vitro and in vivo. The study may provide a new way for the specific targeting therapy to tumors assiociated with EBV infection, and have a great application prospects.

EB病毒（EBV）感染十分广泛，并与鼻咽癌及淋巴瘤等恶性肿瘤发病密切相关。目前，尚无特异方法防治EBV所致的感染及其相关肿瘤，基于单克隆抗体的分子靶向治疗是当前肿瘤治疗研究中最具前景的新手段，但毒副作用大，稳定性差及体内清除过快等问题限制了其广泛应用。亲和体(affibdoy)分子来源于葡萄球菌蛋白A(SPA)，具备以高亲和力与特定蛋白分子结合的特性，同时因穿透性强、稳定性好和易于制备等诸多优点，在肿瘤治疗方面比单克隆抗体更具优势。本研究拟通过基因工程手段和噬菌体展示技术，筛选EBV潜伏膜蛋白2（LMP2）特异性affibdoy分子，并制备特异性affibdoy分子携带细菌毒素的重组蛋白（affitoxin）,进一步通过体内外实验验证EBV LMP2的affitoxin对鼻咽癌的分子靶向结合和治疗作用。为发展基于LMP2亲和体的EBV感染相关肿瘤的特异性靶向治疗提供新途径，应用前景广阔。

EB病毒(EBV)感染感染与鼻咽癌及淋巴瘤等肿瘤发病密切相关,目前尚无特异防治方法。基于单克隆抗体的分子靶向肿瘤治疗是最新治疗手段，但毒副作用大和免疫原性等问题急待解决。本研究针对上述问题开展研究，以葡萄球菌蛋白A亲和体(affibdoy)分子为基础，通过噬菌体展示技术获得了EBV LMP2结合亲和体分子(ZEBV LMP2)，并制备LMP2特异性亲和体携带细菌毒素的重组蛋白(Z EBV LMP2 affitoxin),进一步对筛选的亲和体及其affitoxin分子的分子靶向结合和抑制肿瘤生长作用进行了验证。(1)构建了Z EBV LMP2的随机组合噬菌体展示文库。(2)获得了Z EBV LMP2分子56个，选择了其中的4个(Z EBV LMP2:12，Z EBV LMP2:132，Z EBV LMP2:137，Z EBV LMP2:142)进行了原核表达并制备了纯化蛋白。(3)利用SPR技术验证了Z EBV LMP2分子与EBV LMP2蛋白具有极高的亲和力。(4)利用免疫荧光技术验证了Z EBV LMP2分子特异靶向鼻咽癌细胞表达的EBV LMP2蛋白。(5)利用小动物成像技术验证了Z EBV LMP2分子具有快速靶向EBV LMP2阳性肿瘤的特性。(6)利用原核表达系统制备并纯化了Z EBV LMP2 affitoxin，验证了affitoxin 在对EBV LMP2蛋白的靶向特异性。(7)对亲和体及affitoxin的生物学特性进行了研究：半衰期、LD50和IC50等。(8)Z EBV LMP2affitoxin 蛋白对鼻咽癌荷瘤裸鼠的治疗作用：①建立了鼻咽癌细胞荷瘤裸鼠模型；②验证了其对致瘤作用的显著保护作用；③验证了其显著的靶向抑瘤作用，且毒副作用不明显。本研究为发展基于ZEBV LMP2的鼻咽癌特异性靶向治疗提供新途径，极具应用前景。研究成果多次参加学术会议交流。申报发明专利2项；发表论著7 篇(SCI论文1篇)；培养硕士研究生4人。

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