A型流感病毒节段4 mRNA通过TAP-p15途径出核的分子机制

本研究原计划拟将噬菌体蛋白MS2与GST基因偶联，在HA基因内部插入该基因，并和PR8病毒的其余7个基因共同转染293T细胞，拯救出重组病毒，再继续下面的研究，但在实验进行过程中遇到了阻碍，重组病毒始终没有拯救出来。因此我们对研究计划做出了调整。具体如下：调整1，在利用反向遗传学构建上述重组病毒失败后，我们思考是否节段4基因（即HA基因）内部无法容纳过大的外援基因，或将HA替换是否有难度？于是我们进一步比较利用反向遗传学构建HA、NA改造获取重组病毒的难易，发现在同等的拯救条件下，拯救成功的病毒均为NA替换的病毒。而且发现，不同NA替换的病毒从红细胞上释放的能力存在差异。因此，我们继续做了一系列深入的实验，将A/PR/8(H1N1)病毒的NA基因分别用来自于2009 年甲流H1N1 病毒、高致病性H5N1病毒、低致病性H9N2病毒的NA替换。拯救出重组病毒分别命名为rPR8-H1N1NA、rPR8-H5N1NA和rPR8-H9N2NA。分别测定这些重组病毒的生物学特征。结果发现，NA替换会影响病毒在体外的释放、感染的起始和诱导细胞融合的进程，但不影响其在整个病毒粒子成份中的比重、生长曲线等。进而我们又利用蛋白质学对病毒感染后6h的细胞进行研究，试图找出与诱导细胞融合相关的蛋白。结果发现了4个与细胞融合相关的蛋白。这部分内容分别整理成2篇文章发表（PLoS One. 2013; 8(1): e54334; PLoS One. 2014 Aug 25;9(8):e105947.）。调整2，我们试图研究流感病毒感染时核孔素蛋白的变化动力学，即从出核蛋白入手来研究流感病毒的出核。利用real-time PCR方法测定流感病毒感染不同时间段细胞中核孔素蛋白的变化。结果发现在病毒复制早期，核孔素Nup35和Nup205转录水平很高。病毒复制中后期，Nup54和Nup133转录水平最高。在病毒复制晚期，Nup43、POM、Nup54、Nup88和Nup133核孔素RNA的拷贝数较高。说明NPC中的核孔素蛋白在病毒侵染细胞的早期、中期和晚期发挥作用的蛋白不同。