番茄黄化曲叶病毒抑制转录水平基因沉默和DNA甲基化研究

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is a monopartite begomovirus and has caused devastating damage in China. Our preliminary results showed TYLCV could reverse transcriptional gene silencing (TGS) on transgenic 16-TGS plant. In this project, we will use PVX vector to further characterize the viral suppressor of RNA silencing (VSR) encoded by TYLCV. The infectious clone of TYLCV mutant which introduce VSR mutation will be constructed to test the biological character induced by TYLCV mutant and DNA methylation level of viral mutant genome.In order to evaluate the methylation status at endogenous TGS-silenced loci and the impact of the de novo methylation and HEN1 MTase activity following VSR expression, a transgenic Arabidopsis line expressing VSR will be constructed, in addition to that, RT-PCR, ChIP, methylation sensitive restriction-PCR, bisulfite sequencing and methylation sensitive extension assay will be performed. Yeast two-hybrid analysis, Bimolecular fluorescence complementation and co-immunoprecipitation assay will be carried out to screen the interaction factor in methyl pathway. Based on this research work, it will expand our knowledge of how monopartite TYLCV encodes suppressor to repress TGS and DNA methylation to escape host defense.

本项目拟以我国发生面最广、危害最重的单组份双生病毒番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）为材料，在明确TYLCV具有回复转录水平基因沉默（TGS）的基础上，构建PVX重组表达载体并浸润16-TGS植株以鉴定TYLCV编码的TGS基因沉默抑制子（VSR）。构建VSR突变的病毒突变体的侵染性克隆，分析病毒突变体的生物学性状及其病毒基因组DNA甲基化水平的变化。将VSR遗传转化拟南芥，分析抑制子的表达对拟南芥已发生TGS沉默的内源基因甲基化的影响、从头甲基化（de novo methylation）的影响以及HEN1甲基转移酶活性的影响。利用酵母双杂交、BiFC、Co-IP筛选甲基化途径中与TYLCV基因沉默抑制子互作的寄主因子。研究结果将有助于我们了解单组份双生病毒抑制TGS和寄主DNA甲基化的作用机理，进而阐明病毒致病及逃逸寄主植物防御的分子机制，为TYLCV病毒病的防治提供新的策略和思路。

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）是我国发生面最广、危害最重的单组份双生病毒，本项目是不含卫星DNAβ的单组份双生病毒编码转录水平基因沉默(Transcriptional gene silencing, TGS)抑制子的首次鉴定。TYLCV侵染性克隆接种16-TGS植株，发现TYLCV病毒自身可以抑制TGS。利用马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）异源表达TYLCV编码的6个蛋白（V1、V2、C1、C2、C3、C4）并接种16-TGS植株，发现V2蛋白能像TYLCV那样回复TGS。亚硫酸氢盐测序和甲基化敏感性限制性内切酶PCR实验表明TYLCV与PVX-V2接种的16-TGS植株中35S启动子胞嘧啶甲基化受到抑制。将V2转化拟南芥，获得V2稳定表达的拟南芥遗传材料，与野生型植株相比，转V2基因的拟南芥呈现开花延迟的表型，亚硫酸氢盐测序发现其甲基化受到干扰。构建V2突变的病毒突变体，接种本氏烟，致病性实验发现，V2突变体病毒能侵染本氏烟但不产生典型病毒病症状，且V2突变体病毒失去抑制TGS的能力。以TYLCV V2蛋白为诱饵，利用酵母双杂交系统从本氏烟cDNA文库中筛选与V2蛋白互作的寄主因子。将诱饵质粒pGBKT7-V2和本氏烟cDNA文库质粒共转化酵母Y2HGold，通过SD/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal营养缺陷型培养基筛选，发现13个与TYLCV V2蛋白互作的寄主因子。以NbHDA6为例，NbHDA6基因全长为1,368 bp，预测编码一个含456个氨基酸，分子量约51 kD的蛋白；属于第一类与酵母RPD3蛋白同源的去乙酰化酶，在N端含有一个保守的组蛋白去乙酰化酶结构域；中间含有组蛋白去乙酰化酶必需的活性位点；C端则包含甘氨酸富集区和天冬氨酸富集区。通过双分子荧光互补实验证实V2和NbHDA6能够在烟草表皮细胞中互作，且互作发生在细胞核或细胞质中。将V2和NbHDA6分别进行体外原核表达和纯化，GST pull down实验进一步证实了两者在体外的直接互作，这些结果为下一步探究V2和NbHDA6的互作机理奠定基础。

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