Translocation of single molecules by the pore complex of the nuclear envelope analyzed by low-light level three-channel fluorescence microscopy

核质传输von groüen Proteinen and RNP-Partikeln erfordert zweet gröbeten ere Komponenten：den Kernporenkomplex(NPC)，eine suramolekulare Strukut，die zellkernhülle dechspannt，and KernTransport rezeptoren。这是一种由L等人组成的蛋白质组，它的底物被称为“eskortiert”。他说：“我不能把我的工作做好，因为我不能把我的工作做好，我不能把我的工作做好。”我们在Einzelmolekülmikroskopie von zellulären Proteinen erzielt中发现了实体Fortschritte，并在Der Lage，Einen的体外培养中观察到--Assay des KernTransport，der auf isolierten Kernhüllen basiert，zu entwickeln。我们在这里学习，不在这里学习，也不在这里学习，也不在这里学习，而是在学习的过程中进行进出口。1)Gokalisierung von GFP-markierten NPC-Proteinen，Dive and der Translokation Beteiligt Sind，innerhalb des NPC；2)Tracing von Goçen Importkomplexen während irer Translokation duch npc von perperamabiliererten Zellen；3)跟踪sowohl von Imperatiabiliererten Zellen；3)跟踪Sowohl von Imperatiabiliererten Zellen；3)跟踪Sowohl von Imperatiabilieren Exportkomplexen ard NPC on isolierten Kernhüllen。这是一个非常重要的问题，因为它是一个非常重要的问题，因为它是一个非常复杂的问题。摘要：大分子和RNP颗粒的核质运输包括两个主要组成部分，核孔复合体(NPC)和核转运受体，前者是一种跨越核膜的超分子结构，后者是一类护送转运底物通过NPC的可溶性蛋白质。尽管近年来人们对鼻咽癌和转运受体有了很多了解，但底物-受体复合体通过鼻咽癌转运的分子机制却知之甚少。我们在细胞蛋白质的单分子荧光显微镜方面取得了实质性的进展，并能够建立基于分离的核膜的核转运的体外分析。在这里，我们建议结合我们最近的进展，通过全国人大来研究单一进出口综合体的转移。该项目的主要步骤是：1)涉及易位的GFP标记的NPC蛋白在NPC内的定位；2)通过通透性细胞的NPC追踪大的进口复合体；3)通过分离的核膜的NPC追踪进出口复合体。通过这些手段，我们期望解决转运的中间步骤，测量过渡时间，并产生更详细和定量的核运输模型。

Kernzytoplasmatransport von großen Proteinen und RNP-Partikeln erfordert zwei größere Komponenten: den Kernporenkomplex (NPC), eine supramolekulare Struktur, die die Zellkernhülle durchspannt, und Kerntransportrezeptoren. Letzteres ist eine Gruppe von löslichen Proteinen, die Transportsubstrate durch den NPC "eskortiert". Obwohl die Forschung in den vergangenen Jahren viele Fragen bezüglich der NPC-Struktur und der Transportrezeptoren beantwortet hat, sind die molekularen Mechanismen der Translokation der Substrat-Rezeptor-Komplexe durch den NPC selbst noch sehr unklar. Wir haben substantielle Fortschritte in der Einzelmolekülmikroskopie von zellulären Proteinen erzielt, und waren in der Lage, einen in vitro-Assay des Kerntransports, der auf isolierten Kernhüllen basiert, zu entwickeln. Wir schlagen hier vor, unsere kürzlichen Fortschritte zu kombinieren, und die Translokation einzelner Import- und Exportkomplexe durch den NPC zu studieren. Größere Einzelschritte unseres Projektes sind: 1) Lokalisierung von GFP-markierten NPC-Proteinen, die an der Translokation beteiligt sind, innerhalb des NPC; 2) Tracking von großen Importkomplexen während ihrer Translokation durch NPCs von permeabilisierten Zellen; 3) Tracking sowohl von Import- als auch Exportkomplexen durch die NPCs von isolierten Kernhüllen. Auf diese Weise erwarten wir Zwischenschritte des Translokationsprozesses aufzulösen, Übergangszeiten zu messen, und ein detailliertes, quantitatives Model des Kerntransports zu entwickeln und zu verifizieren. Summary: Nucleocytoplasmic transport of large molecules and RNP particles involves two major components, the nuclear pore complex (NPC), a supramolecular structure spanning the nuclear envelope, and nuclear transport receptors, a family of soluble proteins escorting transport substrates through the NPC. Although much has been learnt in recent years about the NPC and transport receptors the molecular mechanisms, by which substrate-receptor complexes are translocated through the NPC, are little understood. We have achieved substantial progress in single molecule fluorescence microscopy of cellular proteins and were able to establish an in vitro assay of nuclear transport based on isolated nuclear envelopes. Here we suggest to combine our recent progress to study the translocation of single import and export complexes through the NPC. Major steps of the project are: 1) Localisation within the NPC of GFP-tagged NPC proteins implicated in translocation, 2) Tracking of large import complexes during their translocation through the NPC of permeabilized cells, 3) Tracking of both import and export complexes through the NPC of isolated nuclear envelopes. By these means we expect to resolve intermediate steps of translocation, measure transition times and generate a more detailed and quantitative model of nuclear transport.