A nucleosome sliding assay platform to screen inhibitors of SWI/SNF chromatin remodeling complexes

项目摘要 在该提案中，EpiCypher Inc. 将开发第一个商业化的检测方法， 核小体重塑是目前合理药物发现的主要焦点，缺乏HTS工具。 核小体是染色质的基本单位，由约147 bp的DNA紧密包裹在一个八聚体周围组成。 组蛋白 染色质重塑复合物利用ATP破坏DNA-组蛋白相互作用， 重新定位核小体，从而调节DNA进入。异常的核小体组织可以严重破坏 基因表达，DNA修复和细胞分化，并与癌症和疾病，包括 精神分裂症、慢性炎症和智力残疾。重塑复合体在 肿瘤发生和癌症进展代表了表观遗传药物快速发现的新靶点 吸引我们商业伙伴的注意特别有治疗意义的是SWI/SNF家族， 染色质重塑复合物，20%的人类癌症含有亚基突变。 SWI/SNF 复合物由重塑ATP酶（SMARCA 2 [BRM]或SMARCA 4 [BRG 1]）、三个核心组成。 蛋白质，以及另外四到八种辅助蛋白（因细胞类型而异）， 定位的复杂性和刺激催化。 SWI/SNF复合物的ATP酶催化结构域 已经在多项研究中被确定为治疗开发的合理靶点。 然而，染色质 目前缺乏适合高通量筛选的重塑测定，EpiCypher将 通过这个提案。我们将评估使用重组核小体（rNucs）的可行性。 在滑动DNA序列上均匀组装，作为高通量的生物学相关的 筛选平台，以鉴定直接抑制染色质重塑的化合物。 在目标1中， EpiCypher将开发一种创新的基于rNuc的核小体滑动试验， 在SWI/SNF重新定位组蛋白八聚体以暴露Dam后，可以放射性标记的DNA模板 甲基化位点（GATC）。 在目标2中，我们将通过测定染色质来验证滑动rNuc底物 用分离的SMARCA 4酶进行重构活性。在第二阶段，我们将专注于商业生产， 该高通量滑动rNuc筛选平台用于鉴定靶向SWI/SNF的抑制剂， 染色质重塑家族 这项高度创新的研究计划将使治疗发展 染色质重塑复合物是目前缺乏足够筛选的主要药物靶点 工具.

PROJECT SUMMARY  In  this  proposal,  EpiCypher  Inc.  will  develop  the  first  commercially  available  assay  to  monitor  nucleosome  remodeling,  a  major  current  focus  for  rational  drug  discovery  that  is  starved  of  HTS  tools.  Nucleosomes are the basic units of chromatin, made up of ~147 bp DNA tightly wrapped around an octamer of  histone  proteins.  Chromatin  remodeling  complexes  utilize  ATP  to  disrupt  DNA-­histone  interactions  and  reposition nucleosomes, thus regulating DNA access. Aberrant nucleosome organization can severely disrupt  gene expression, DNA repair and cellular differentiation, and is associated with cancer and disorders including  schizophrenia, chronic inflammation, and intellectual disability. The profound role of remodeling complexes in  tumorigenesis  and  cancer  progression  represents  a  new  target  class  for  epigenetic  drug  discovery  rapidly  gathering attention from our commercial partners. Of particular therapeutic interest are the SWI/SNF family of  chromatin  remodeling  complexes,  with  20%  of  all  human  cancers  harboring  a  subunit  mutation.  SWI/SNF  complexes  are  comprised  of  a  remodeling  ATPase  (SMARCA2  [BRM]  or  SMARCA4  [BRG1]),  three  core  proteins,  and  an  additional  four  to  eight  accessory  proteins  (varying  by  cell  type)  that  direct  genomic  localization  of  the  complex  and  stimulate  catalysis.  The  catalytic  ATPase  domains  of  SWI/SNF  complexes  have  been  identified  in  multiple  studies  as  rational  targets  for  therapeutic  development.  However,  chromatin  remodeling  assays  amenable  to  high  throughput  screening  are  currently  lacking,  a  problem  EpiCypher  will  address through this proposal. We will assess the feasibility of using recombinant nucleosomes (rNucs)  homogenously  assembled  on  sliding  DNA  sequences  as  a  high-­throughput,  biologically  relevant  screening  platform  to  identify  compounds  that  directly  inhibit  chromatin  remodeling.  In  Aim  1,  EpiCypher  will  develop  an  innovative  rNuc-­based  nucleosome  sliding  assay,  which  capitalizes  on  a  unique  DNA  template  that  can  be  radiolabeled  after  SWI/SNF  repositions  the  histone  octamer  to  expose  a  Dam  methylation  site  (GATC).  In  Aim  2,  we  will  validate  the  sliding  rNuc  substrates  by  assaying  chromatin  remodeler activity with the isolated SMARCA4 enzyme. In Phase II, we will focus on commercial production of  this high-­throughput sliding rNuc screening platform for the identification of inhibitors that target the SWI/SNF  chromatin  remodeling  family.  This  highly  innovative  research  program  will  enable  therapeutic  development  toward chromatin remodeling complexes, a major class of drug targets that currently lack adequate screening  tools.