Effect of drugs of abuse on CNS HIV-1 reservoirs and neuropathogenesis

项目摘要 本申请的长期目标是研究持续存在于CNS中的HIV-11储库， 非法药物在建立和重新激活潜在储存库方面的作用。潜伏感染细胞的持续存在 中枢神经系统中的HIV-1感染是根除HIV-1的主要障碍。目前消除潜在水库的战略包括 这是一种“休克和杀死”疗法，针对的是外周血，而外周血仅占总储存量的1%。 目前，是否有可能设想类似的策略来根除HIV感染的CNS细胞， 未知 除了缺乏关于CNS HIV+细胞中潜伏期的知识以及潜伏期的影响外， 逆转剂、HIV感染人群中常见的非法药物构成了进一步的复杂性。许多 已知非法药物会刺激HIV-1复制。由于目前测量外周血的方法 HIV储库不适用于实体组织或复制不良的细胞，如巨噬细胞、小胶质细胞 和星形胶质细胞。 我们已经开发了一种新的，单细胞单分子，多重， 免疫荧光（IF）和基于RNA FISH的检测（SMIRA），以检测HIV-11活跃的细胞 复制 使用自动化，可以扫描大量细胞。 在本提案中，我们将采用 一种新的方法，首先定量和表征细胞系模型中的潜伏期，然后是大脑中的潜伏库 衍生的小胶质细胞和星形胶质细胞，并描绘了三种滥用药物（甲基苯丙胺，可卡因 和大麻）对潜伏细胞形成效率、潜伏细胞再活化速率的影响，以及 建立血脑屏障潜伏期。提出了三个目标。在目标1中，我们将研究 通过体外和体外实验， 潜伏期的体内模型。 首先，我们将使用永生化的人单核细胞和小胶质细胞系来研究 使用SMIRA的再活化动力学和METH、可卡因和大麻对再活化的影响。 随后将使用原代CNS细胞进行类似研究。在目标2中，我们将研究非法药物的作用 关于在穿过BBB的CNS细胞中建立HIV储库。使用SMIRA检测HIV-11+细胞，我们将 确定滥用药物、抗逆转录病毒药物和添加LRA的相对效应，以确定潜伏期 在BBB。在目标3中，我们将研究非法药物对HIV-1感染者中枢神经系统HIV储库的影响。 使用来自有或无非法药物使用史的HIV阳性个体的脑尸检样本（来自 曼哈顿脑库（NNTC），我们将描述小胶质细胞和星形胶质细胞潜伏细胞的相对频率 使用SMIRA和最新技术， 高速/分辨率的全载玻片扫描仪，PerkinElmer Pannoramic 250 Flash II。我们将研究 药物滥用对再激活率的影响 拟议的研究将提供宝贵的研究工具 建立和重新激活CNS潜伏期，并提供药物筛选试验 在未来消灭这些潜伏的细胞。

Project summary    The long term goal of this application is to study HIV-­1 reservoirs that persist in CNS and to understand  the role of illicit drugs in establishing and reactivating the latent reservoirs. Persistence of latently infected cells  in CNS poses a major barrier for HIV-­1 eradication. Current strategies to eliminate the latent reservoirs include  a  “shock  and  kill”  therapy  and  is  aimed  at  peripheral  blood,  which  constitutes  only  1%  of  the  total  reservoirs.  Whether  it  is  possible  to  envision  similar  strategies  for  the  eradication  of  HIV-­infected  CNS  cells  is  currently  unknown.  In  addition  to  the  lack  of  knowledge  about  latency  in  CNS  HIV+  cells  and  the  effects  of  latency  reversing agents, illicit drugs common within the HIV-­infected populations constitute a further complexity. Many  illicit drugs are known to stimulate HIV-­1 replication. Since the current method to measure the peripheral blood  HIV reservoir is not applicable to solid tissues or to cells that replicate poorly such as macrophages, microglia  and  astrocytes  found  in  the  brain.  We  have  developed  a  novel,  Single  cell-­single  molecule,  Multiplex,  Immunofluorescence  (IF)  and  RNA  FISH-­based  Assay  (SMIRA)  to  detect  cells  in  which  HIV-­1  is  actively  replicating.  Using  automation,  a  large  number  of  cells  can  be  scanned.  In  this  proposal,  we  will  employ  this  novel method to first quantitate and characterize latency in cell line models, then the latent reservoirs in brain  derived microglia and astrocytes and delineate the effect of three drugs of abuse (methamphetamine, cocaine  and  cannabis)  on  the  efficiency  of  formation  of  latent  cells,  the  rate  of  reactivation  of  latent  cells,  and  establishment of latency across blood-­brain-­barrier (BBB). Three Aims are proposed. In Aim 1,  we will study  the role of illicit drugs on the reactivation of latently infected CNS-­derived cells by establishing in vitro and ex  vivo  models  of  latency.  First,  we  will  employ  immortalized  human  monocyte  and  microglial  cell  lines  to  study  the  kinetics  of  reactivation  and  the  effect  of  METH,  Cocaine  and  cannabis  on  the  reactivation  using  SMIRA.  This will be followed by similar studies using a primary CNS cells. In Aim 2, we will study the role of illicit drugs  on the establishment of HIV reservoirs in CNS cells across BBB. Using SMIRA to detect HIV-­1+ cells, we will  determine  the  relative  effect  of  drugs  of  abuse,  antiretrovirals  and  the  addition  of  LRAs  to  establish  latency  across BBB. In Aim 3, we will study the effect of illicit drugs on CNS HIV reservoirs in HIV-­infected individuals.  Employing  brain  autopsy  samples  from  HIV+  individuals  with  or  without  illicit  drug  use  history  (from  the  Manhattan Brain Bank (NNTC), we will characterize the relative frequency of microglial and astrocyte latent cell  reservoirs  in  which  HIV-­1  is  actively  replicating  vs.  those  that  are  latent,  using  SMIRA  and  state-­of-­the-­art,  high-­speed/resolution whole slide scanner, the PerkinElmer Pannoramic 250 Flash II. We will study the effect  of  drug  abuse  on  the  rates  of  reactivation.  The  proposed  studies  will  provide  valuable  tools  to  study  establishment and reactivation of CNS latency in response to illicit drugs and provides a drug screening assay  to eradicate these latent cells in the future.