Cell-Specific Visualization of Endogenous Proteins

项目摘要 BRAIN计划的一个主要目标是了解神经元的连接和可塑性， 动物行为神经元的功能和连通性是由它们的组成部分建立和表现的。 proteins.监测行为动物中特定神经元亚型中单个蛋白质的组织 因此可以提供动物行为背后的细胞和电路特性的重要读数。 然而，它仍然具有挑战性的可视化内源性突触蛋白组织在个别神经元， 活着的动物大多数研究依赖于目标荧光标记蛋白的过表达。蛋白 过表达可以改变蛋白质的化学计量、运输、亚细胞定位和细胞信号传导，最终 影响细胞和电路功能。虽然“敲门"策略原则上可以绕过问题， 与蛋白质过表达相关，它们导致标记蛋白的整体表达，导致高表达。 荧光背景和缺乏细胞特异性对比。用于可视化的其他替代标记方法 内源性蛋白质，如荧光标记的胞内抗体和CRISPR-GFP的细胞内表达， 介导的基因编辑也有其自身的局限性，包括潜在的脱靶效应。 为了解决上述问题，我们最近开发了一种新的遗传策略，称为内源性标记， 外显子复制（ENABLED）。我们用这种方法标记了突触后关键标记蛋白PSD-β 95与黄色荧光蛋白mVenus在所有神经元中，在稀疏的神经元子集中，或在特定的 神经元亚型与通过过表达可视化PSD-1095的常规方法不同，我们的策略 不会导致神经元功能的改变，并且首次允许在24小时内监测PSD-95。 内源性水平的个体神经元在活的小鼠。尽管有这些优势，启用策略可以 进一步优化以扩大其适用性并提高其灵敏度。此外，全面 为了检查神经元的功能和连接性，需要在两个区域标记额外的突触蛋白 突触前和突触后两侧。在此，我们要求提供资金，以优化启用战略，并将其用于 标记小鼠中另外12种关键突触蛋白。我们还将产生ENABLED小鼠，其中 可以使用不同的颜色标记突触蛋白以同时成像。我们制造的试剂 提供给神经科学界，为研究人员提供前所未有的能力， 监测行为动物在生理条件下的突触连接和可塑性。

PROJECT SUMMARY  A major goal of the BRAIN initiative is to understand neuronal connectivity and plasticity in the context of  animal behavior. The functions and connectivity of neurons are established and manifested by their constituent  proteins. Monitoring the organization of individual proteins in specific neuronal subtypes in behaving animals  may therefore provide an important readout of cellular and circuit properties underlying animal behavior.  However, it remains challenging to visualize endogenous synaptic protein organization in individual neurons in  living animals. Most studies rely on the overexpression of fluorescently tagged proteins of interest. Protein  overexpression can alter protein stoichiometry, trafficking, subcellular localization, and cell signaling, ultimately  affecting cellular and circuit functions. Although ‘knock-­in’ strategies can in principle bypass problems  associated with protein overexpression, they result in global expression of the labeled protein, leading to high  fluorescence background and a lack of cell-­specific contrast. Other alternative labeling methods for visualizing  endogenous proteins, such as the intracellular expression of fluorescently tagged intrabodies and CRISPR-­ mediated gene editing, also have their own limitations, including potential off-­target effects.   To solve the above problems, we recently developed a novel genetic strategy called endogenous labeling via  exon duplication (ENABLED). We have used this method to label the critical postsynaptic marker protein PSD-­ 95 with the yellow fluorescent protein mVenus in all neurons, in a sparse subset of neurons, or in specific  neuronal subtypes. Unlike the conventional approach to visualizing PSD-­95 via overexpression, our strategy  does not result in altered neuronal functions, and, for the first time, allows for the monitoring of PSD-­95 at  endogenous levels in individual neurons in living mice. Despite these advantages, the ENABLED strategy can  be further optimized to broaden its applicability and to enhance its sensitivity. Furthermore, to comprehensively  examine neuronal functions and connectivity, additional synaptic proteins will need to be labeled at both the  presynaptic and postsynaptic sides. Here, we request funds to optimize the ENABLED strategy and use it to  label 12 additional critical synaptic proteins in mice. We will also generate ENABLED mice in which the  synaptic proteins can be labeled using different colors for simultaneous imaging. The reagents we generate will  be made available to the neuroscience community to provide researchers with an unprecedented ability to  monitor synaptic connectivity and plasticity under physiological conditions in behaving animals.