The immunomodulatory role of Ankyrin repeat containing effectors expressed by Coxiella burnetii

白纹伊蚊可引起人畜共患热病，主要存在于单核细胞/巨噬细胞内。 操纵其先天免疫反应。白纹伊蚊需要从头开始合成蛋白质和蛋白质。 功能性转录因子IVB分泌调控系统(T4BSS)调节真核生物转录。 核因子-κB因子(NF-κB)是天然免疫反应的关键监管机构。 包括沙门氏菌在内的病原体可以传递含有Ank的真核型抗体效应器，从而劫持了NF-κB。 信令。C、C、B、C、C、G、A、C、F、A、G、C、A、C、C、A、C、B、C、F、G、G、C、A、C、C、F、G、G、C、A、C、F、G、T、C、F、G、T、C、N、C、F、G、T、G、D、C、F、G -K)。实验发现：1)AnkK和AnkC显著促进了C. 抑制核因子-κB依赖的蛋白基因的表达，以及(2)血管紧张素转换酶基因或血管紧张素转换酶基因的异位表达。 HEK293/hTLR4-MD2-CD14+细胞可阻断核内核因子-κB的积聚。这是主要的研究焦点。 在这项新的提案中，预计将从机械上确定C.Kburnetii的两个效应器，即AnkK和AnkC，如何发挥作用。 调节核因子-κB，以进一步促进细胞内信号的存活和复制。 完成以下具体目标：1.确定安卡拉和安卡拉对中国的贡献比例。 卡氏杆菌的毒力。最有效的假说是卡氏杆菌、AnkK和AnkC促进了这种病毒的产生。 病原菌通过调节核因子-κB的激活来增强毒力。为了测试这一点，我们预计不会产生这种病毒。 白纹伊蚊和南美白纹伊蚊(NM II)菌株K：：TN和突变体C：：TN的互补作用 研究其在组织中的表型及p65核转位基因的表达。 细胞培养。为了更好地研究体内生长和救援，我们将继续采用SCID小鼠/新城疫II病毒感染。 模型。在使用CyA易位检测之后，我们将测试T4型细胞分泌系统。 要求。此外，我们还将生成ΔDOTA、ΔAnkK、ΔAnkC和AnkC基因敲除以及它们的基因敲除。 在强毒白纹伊蚊(NM I)中补充毒株，以感染C57BL/6N小鼠，并确定。 AnkK基因和AnkC基因在体内对细菌毒力的相对贡献率。 在白纹伊蚊感染过程中，依赖于AnkK/AnkC的κB的抑制机制。 该假说的工作原理是，在最具典范的Nf-κB中，AnkC与东道主和目标进行互动。 P65的途径是或潜在地消耗P65，以阻止其主要的核转位。我们将不会消耗P65。 宿主细胞需要调查KNM II基因K：：TN和KNKC：：TN突变体的生长和救援能力。我们将继续检查。 基因的表达、磷酸化和降解以及它们各自组成成分的状态。 NF-κB途径在稳定表达EGFP标记的AnkK和AnkC的THP-1细胞系中被发现。 宿主结合蛋白合作伙伴(S)，将继续与稳定的THP-1细胞一起进行下拉检测(gfp-teltrap)。 表达绿色荧光蛋白-AnkK基因和基因-AnkC基因的目的是为了确定C-AnkC基因或AnkC基因是否驱动了基因的调制。 宿主对p65依赖的基因在感染细胞中的表达，我们将不再进行scRNA-seq和p65/芯片的检测。 SEQ是一种实验。

C.  burnetii  causes  the  zoonotic  disease  Q  fever  and  resides  within  monocytes/macrophages  manipulating  innate  immune  response.  C.  burnetii  requires  de  novo  protein  synthesis  and  a  functional  Type  IVB  Secretion  System  (T4BSS)  to  modulate  host  the  eukaryotic  transcription  factor  Nuclear  Factor-­κB  (NF-­κB)  signaling  an  essential  regulator  of  innate  response.  Multiple  pathogens including C. burnetii deliver eukaryotic-­type Ank-­containing effectors to hijack NF-­κB  signaling. C. burnetii Nine Mile isolate encodes 5 Ank-­containing effectors (AnkA, -­C, -­F, -­G, and  -­K). Experiments found that 1) AnkK and AnkC significantly contributes to C. burnetii’s ability to  inhibit  NF-­κB  dependent  gene  expression  and  2)  ectopic  expression  of  AnkK  or  AnkC  in  HEK293/hTLR4-­MD2-­CD14 cells blocks accumulation of NF-­κB in the nucleus. The central focus  of  this  proposal  is  to  determine  mechanistically  how  the  C.  burnetii  effectors,  AnkK  and  AnkC,  modulate  NF-­κB  to  promote  intracellular  survival  and  replication.  The  central  hypothesis  by  accomplishing the following specific aims: 1. Determine the contribution of AnkK and -­C to  C.  burnetii’s  virulence.  The  working  hypothesis  is  that  C.  burnetii  AnkK  and  AnkC  promotes  pathogen  virulence  by  modulating  NF-­κB  activation.    To  test  this,  we  will  generate  complementation  strains  of  C.  burnetii  NM  II  (NM  II)  ankK::Tn  and  ankC::Tn  mutants  and  investigate  in  vitro  growth  rescue  and  p65  nuclear  translocation  for  phenotype  rescue  in  tissue  culture cells. To investigate in vivo growth rescue, we will employ the SCID mice/NM II infection  model.  Employing  CYA-­translocation  assays,  we  will  then  test  Type  4  secretion  system  requirement. Furthermore, we will generate ΔdotA, ΔAnkK, and ΔAnkC gene knockouts and their  complementation strains in virulent C. burnetii NM I (NM I) to infect C57Bl/6N mice and determine  the  relative  contribution  of  AnkK  and  AnkC  to  bacterial  virulence  in  vivo.  2.  Determine  the  mechanism  of  AnkK/AnkC-­dependent  NF-­κB  inhibition  during  C.  burnetii  infection.  The  working hypothesis is C. burnetii AnkK or AnkC interacts with host targets in the canonical NF-­κB  pathway  or  potentially  sequesters  p65  to  block  its  nuclear  translocation.  We  will  deplete  p65  in  host cells to investigate growth rescue of NM II ankK::Tn and ankC::Tn mutants. We will examine  expression,  phosphorylation  and  degradation  status  of  individual  components  of  the  canonical  NF-­κB pathway in stable THP-­1 cell lines expressing eGFP-­tagged AnkK and AnkC. To identify  host-­binding  partner(s),  pull  down  assays  (GFP-­trap)  will  be  performed  with  THP-­1  stable  cells  expressing eGFP-­AnkK and –AnkC. To determine C. burnetii AnkK or AnkC driven modulation of  host p65-­dependent gene expression in infected cells, we will perform scRNA-­seq and p65/ChIP-­ seq experiments.