Identification and Role of Type IV Secretion Effector Proteins in Coxiella burnetii

点击翻译按钮获取中文摘要

Acute and chronic Q fever infections in humans are caused by Coxiella burnetii, which traffics to  and  replicates  in  Coxiella-­containing  vacuoles  (CCV).  Infection  suppresses  macrophage  activation  in  a  type  4  secretion  system-­dependent  manner,  hence  our  central  hypothesis  is  characterization of T4SS-­dependent effector molecules in vitro and in vivo will define “stealthy”  virulence  genes.  This  application  will  identify  T4SS-­dependent  virulence  determinants  that  modulate  macrophage  signaling  pathways  using  pathogen  effector  mutants  and  host  signaling  mutants  that  are  essential  for  restricting  replication  or  modulating  response  to  infection.  Aim  1.  Identify the range of T4SS dependent manipulation of macrophage. The working hypothesis  is multiple T4SS effectors manipulate the response to infection in macrophages. Using a primary  bone marrow derived macrophage (BMDM) cell culture that enables C. burnetii, RSA439 (NMII)  to  replicate.  We  will  extensively  characterize  BMDM  using  transcriptomic  (including  single  cell  analysis), metabolomics and flow cytometric analysis to comprehensively map T4SS dependent  pathway  modulation  of  macrophage  activation.  Aim  2.  Identify  T4SS  effectors  which  manipulate  immune  signaling.  The  working  hypothesis  is  T4SS  effectors  target  specific  activation  signaling  pathways.  To  identify  this  broad  class  of  T4SS  effectors,  tagged  C.  burnetii  T4SS  substrates  will  be  transfected  into  macrophages  in  the  context  of  signaling  agonists.  A  complementary  approach  will  use  T4SS  mutants  to  identify  infection  that  does  not  modulate  innate activation. Aim 3. Establish mechanistic basis for T4SS effector modulation. Current  candidates derived from preliminary data include;; a) 2 Ankyrin repeat-­containing proteins which  dampen agonist driven NF-­κb;; b) 5 T4SS effectors that are essential for replication in BMDM;; and  c)  3  T4SS  effectors  which  traffic  to  the  nucleus  (nucleomodulins).  We  will  identify  host  binding  partners  using  pull-­down  methods  and  define  their  role  in  disease  using  host  knock-­down  or  knock-­out approaches. Each effector will be analyzed with either Tn or site-­specific mutants.