Identification and Role of Type IV Secretion Effector Proteins in Coxiella burnetii

人类的急性和慢性Q热感染是由贝氏柯克斯体引起的， 并在含有Coxiella-Escherichia的空泡（CCV）中重复。 感染抑制巨噬细胞 以4型分泌系统依赖的方式激活，因此我们的中心假设是 体外和体内T4 SS-β依赖性效应分子的表征将定义“隐形” 毒力基因 本申请将鉴定T4 SS-β 1依赖性毒力决定因子， 使用病原体效应突变体和宿主信号传导调节巨噬细胞信号传导途径 限制复制或调节对感染的反应所必需的突变体。 目标1。 确定T4 SS依赖的巨噬细胞操纵的范围。工作假设 是多种T4 SS效应物操纵巨噬细胞对感染的反应。使用主 骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）细胞培养物，其使C.伯内特氏菌，RSA 439（NMII） 来复制 我们将使用转录组学（包括单细胞 分析）、代谢组学和流式细胞术分析，以全面绘制T4 SS依赖性 巨噬细胞活化的途径调节。 目标二。 识别T4 SS效应物， 操纵免疫信号 工作假设是T4 SS效应物靶向特异性 激活信号通路。 为了识别这一广泛类别的T4 SS效应物，标记了C。 贝氏 T4 SS底物将在信号传导激动剂的情况下转染到巨噬细胞中。 一 互补方法将使用T4 SS突变体来鉴定不调节 先天激活目标3。建立T4 SS效应器调节的机制基础。电流 来自初步数据的候选物包括：a）2种含有锚蛋白重复序列的蛋白质， 抑制激动剂驱动的NF-κ B B; NF-κ B B）5 T4 SS效应物，其对于BMDM中的复制是必需的; NF-κ B和 c）3种运输至细胞核的T4 SS效应物（核调节蛋白）。 我们将识别主机绑定 合作伙伴使用下拉的方法，并确定其在疾病中的作用， 淘汰赛即将来临。将用Tn或位点特异性突变体分析每个效应子。

Acute and chronic Q fever infections in humans are caused by Coxiella burnetii, which traffics to  and  replicates  in  Coxiella-­containing  vacuoles  (CCV).  Infection  suppresses  macrophage  activation  in  a  type  4  secretion  system-­dependent  manner,  hence  our  central  hypothesis  is  characterization of T4SS-­dependent effector molecules in vitro and in vivo will define “stealthy”  virulence  genes.  This  application  will  identify  T4SS-­dependent  virulence  determinants  that  modulate  macrophage  signaling  pathways  using  pathogen  effector  mutants  and  host  signaling  mutants  that  are  essential  for  restricting  replication  or  modulating  response  to  infection.  Aim  1.  Identify the range of T4SS dependent manipulation of macrophage. The working hypothesis  is multiple T4SS effectors manipulate the response to infection in macrophages. Using a primary  bone marrow derived macrophage (BMDM) cell culture that enables C. burnetii, RSA439 (NMII)  to  replicate.  We  will  extensively  characterize  BMDM  using  transcriptomic  (including  single  cell  analysis), metabolomics and flow cytometric analysis to comprehensively map T4SS dependent  pathway  modulation  of  macrophage  activation.  Aim  2.  Identify  T4SS  effectors  which  manipulate  immune  signaling.  The  working  hypothesis  is  T4SS  effectors  target  specific  activation  signaling  pathways.  To  identify  this  broad  class  of  T4SS  effectors,  tagged  C.  burnetii  T4SS  substrates  will  be  transfected  into  macrophages  in  the  context  of  signaling  agonists.  A  complementary  approach  will  use  T4SS  mutants  to  identify  infection  that  does  not  modulate  innate activation. Aim 3. Establish mechanistic basis for T4SS effector modulation. Current  candidates derived from preliminary data include;; a) 2 Ankyrin repeat-­containing proteins which  dampen agonist driven NF-­κb;; b) 5 T4SS effectors that are essential for replication in BMDM;; and  c)  3  T4SS  effectors  which  traffic  to  the  nucleus  (nucleomodulins).  We  will  identify  host  binding  partners  using  pull-­down  methods  and  define  their  role  in  disease  using  host  knock-­down  or  knock-­out approaches. Each effector will be analyzed with either Tn or site-­specific mutants.