Mechanism of Cellulose Synthesis and Transport Across Biological Membranes

纤维素是地球上最丰富的生物聚合物。它是一种主要由葡萄糖和分子组成的线性聚合物。 不仅由维管束植物组成，还包括绿色藻类、细菌，甚至是被囊动物。细菌和纤维素是最重要的。 经常在生物膜中发现细菌，这些生物膜是固着的，细菌群落被包裹在一个完整的三维生物矩阵中。 多糖、蛋白质、纤维、蛋白质和核酸。细菌和生物膜对抗生素的敏感性较低。 约80%的医院感染是由治疗方法引起的，因此给患者带来了巨大的医疗风险。 人类健康。要开发一种新的治疗方法来治疗或预防细菌生物被膜和感染，需要一份详细的报告。 从机理上理解生物膜的组成成分，特别是多糖，它们是如何被合成的。 存放在牢房外。这一拟议的全球研究机构寻求提供更多信息。 细菌和纤维素的生物合成是研究细菌和纤维素的作用机制和调控机制的理想模型和系统。 多糖类的分泌。革兰氏阴性菌可以产生细菌，并通过一种多亚单位的复合体分泌纤维素。 由BCSA的内膜、BCSB的亚基、周质的BcsZ水解酶以及BCSB的内膜组成。 BCSC的外膜和亚单位。在我们之前的工作中，我们提供了详细的机械性的洞察力，了解了BCSC的内部是如何形成的。 膜整合的BCSA-B复合体延长了纤维素链的长度，并使其在整个过程中转移到主要的聚合物链上。 质膜。虽然目前的数据可以解释纤维素膜是如何延伸的，但我们目前还没有关于它的更多信息。 纤维素的生物合成是如何启动的。这个问题将通过生物化学的方法来解决，目的是通过重组来实现这一目标。 在体外，从无细胞生物中引发的反应表达了一种没有启动的纤维素A合成酶。 BCSA不断地拉长纤维素膜，并将聚合物推入由其表面形成的跨膜通道。 自己的膜-横跨整个地区。他们的结构快照显示了不同的纤维素酶和合成酶在纤维素合成过程中的状态。 合成酶和细胞膜的移位可以为研究这一过程中的构象变化提供更深入的见解。 目前还没有对纤维素转运率和加工效率要求的精准分析报告。 失踪。我们将在一个单一的分子水平上解决这些问题，使用一种光学上被困住的原子和催化剂。 活跃的BCSA-üB在目标为1b的情况下提供复杂的服务。 穿过革兰氏底片中的内膜和外膜，纤维素膜必须穿过细胞质，穿过外膜。 在到达细菌生物膜基质之前，这段细菌的移位路径很可能是由细菌直接作用形成的。 外质膜组分和外膜组分的相互作用与内膜上的BCSA-B复合体相互作用。 在第二个目标中，我们将寻求方法来重建从纳米磁盘和蛋白质脂质体中提取的纤维素膜和蛋白质脂质体的外膜运输系统-- 重组后的组件用于详细的动力学、生物化学、生物化学和生物相互作用研究。这些信息将提供给用户。 支持我们为进一步确定一种内部结构和外部结构--跨越纤维素酶和合成酶的外部膜--所做的努力。 正如我们在《目标3》中所概述的那样，我们将继续使用X射线、结晶学和/或电子显微镜来确定是否存在。 单个外质膜组分和外膜组分的结构特征及其与BCSA-B的相互作用。

Cellulose  is  the  most  abundant  biopolymer  on  earth.  It  is  a  linear  polymer  of  glucose  molecules  primarily  formed  by  vascular  plants  but  also  by  green  algae,  bacteria,  and  even  tunicates.  Bacterial  cellulose  is  frequently  found  in  biofilms,  which  are  sessile  bacterial  communities  encased  in  a  3-­dimensional  matrix  of  polysaccharides, proteinaceous fibers, and nucleic acids. Biofilm bacteria are less susceptible to anti-­microbial  treatments and are responsible for about 80% of hospital-­derived infections, thereby posing a significant risk to  human  health.  Developing  novel  therapeutics  to  treat  or  prevent  biofilm  infections  requires  a  detailed  mechanistic understanding of how the biofilm constituents, in particular polysaccharides, are synthesized and  deposited outside the cell. The proposed research seeks to provide this information.  Bacterial  cellulose  biosynthesis  is  an  ideal  model  system  to  study  the  mechanism  and  regulation  of  exo-­ polysaccharide  secretion.  Gram-­negatives  produce  and  secrete  cellulose  via  a  multi-­subunit  complex  consisting  of  the  inner  membrane  BcsA  and  BcsB  subunits,  the  periplasmic  BcsZ  hydrolase,  as  well  as  the  outer  membrane  subunit  BcsC.  Our  previous  work  provided  detailed  mechanistic  insights  into  how  the  inner  membrane-­integrated BcsA-­B complex elongates the cellulose chain and translocates the polymer across the  plasma membrane. While current data explain how cellulose is extended, we currently have no information on  how cellulose biosynthesis initiates. This question will be addressed biochemically in Aim 1a by reconstituting  the initiation reaction in vitro from cell-­free expressed 'uninitiated' cellulose synthase.      BcsA  processively  elongates  cellulose  and  pushes  the  polymer  into  a  transmembrane  channel  formed  by  its  own  membrane-­spanning  region.  Structural  snapshots  of  different  cellulose  synthase  states  during  cellulose  synthesis and membrane translocation provide insights into conformational changes during this process. Yet a  precise  analysis  of  energetic  requirements  for  and  processivity  rates  of  cellulose  translocation  is  currently  missing. We will address these questions on a single molecule level using an optically trapped and catalytically  active BcsA-­B complex in Aim 1b.   Past the inner membrane and in Gram-­negatives, cellulose must cross the periplasm and the outer membrane  before  reaching  the  biofilm  matrix.  This  section  of  the  translocation  path  is  most  likely  formed  by  a  direct  interaction of periplasmic and outer membrane components with the BcsA-­B complex at the inner membrane.  In  Aim  2  we  seek  to  reconstitute  outer  membrane  transport  of  cellulose  from  nanodisc  and  proteoliposome-­ reconstituted  components  for  detailed  kinetic,  biochemical,  and  interaction  studies.  This  information  will  support  our  efforts  to  determine  the  structure  of  an  inner  and  outer  membrane-­spanning  cellulose  synthase  complex  as  outlined  in  Aim  3.  We  will  use  X-­ray  crystallography  and/or  electron  microscopy  to  determine  the  structure of individual periplasmic and outer membrane components as well as their complexes with BcsA-­B.