Endogenous ligand of the NK activating receptor NKp46

自然杀伤细胞（NK）是抵抗感染和癌症的第一道防线。NK细胞的激活受 通过激活和抑制NK受体传递的信号的平衡。 活化受体NKp 46是 被认为是针对自体、同种异体和异种的天然细胞毒性中的主要活化受体。 靶细胞 NKp 46在哺乳动物中是保守的，并且几乎在NK上普遍表达，这表明它是 功能重要。 编码NKp 46基因的Ncr 1缺陷小鼠的肿瘤免疫功能受损 监测，有较严重的甲型流感，偏肺病毒，呼肠孤病毒和梭杆菌感染和移植 抗宿主病 这种重要的活化NK受体的内源性配体尚不清楚，尽管 几十年的寻找。 我们的初步工作表明，NKp 46识别钙网蛋白（CRT）， 通常存在于内质网（ER）内，但在ER-1应激细胞中转移到细胞表面 或者用一些抗癌药物治疗的肿瘤细胞。一种NKp 46-β IG融合蛋白特异性地拉低细胞表面 CRT（外显CRT）和使用表面等离子体共振的初步数据表明特异性结合。 敲门 下调CRT编码基因CALR或在CRT上添加阻断抗体可抑制NKp 46介导的NK细胞 杀人某些化疗药物和放疗诱导免疫刺激型程序化细胞 癌细胞死亡，称为免疫原性细胞死亡（ICD），它会在癌细胞死亡后清除存活的肿瘤细胞。 治疗 ICD背后的机制与体外循环CRT有关，其作为“吃我”/吞噬细胞 树突状细胞信号，然后通过交叉免疫激活抗肿瘤CD 8 + T细胞。我们假设 NKp 46识别外膜CRT，并且NK通过NKp 46与外膜CRT的相互作用识别ER-CRT应激细胞， 在ICD和NK细胞介导的免疫防御中起重要作用。初步数据显示， 用ZIKV（其在ER中复制并引起ER应激）处理肿瘤细胞系，以及用ICD-GFP诱导的肿瘤细胞系处理肿瘤细胞系。 化疗药物诱导了体外CRT和NKp 46依赖性NK杀伤。 此外，CRT-PCR包被的肿瘤细胞 成为NK细胞靶标，并且NK细胞系中的NCR 1敲除强烈抑制其对暴露于NCR 1的靶标的杀伤。 阴极射线管。 为了验证我们的假设，我们将首先通过使用生物物理方法证实外膜CRT是NKp 46的配体， 表征外膜CRT和NKp 46结合的方法，以及鉴定CRT中负责NKp 46结合的区域的方法。 互动将研究NK细胞上NKp 46的基因操作或阻断以及肿瘤靶点上的体外CRT 这种受体-配体相互作用在NK识别、免疫突触形成和功能反应中作用 感染和肿瘤细胞。 未处理的肿瘤细胞和用ICD-10诱导和治疗的肿瘤细胞的NK杀伤 将比较非诱导性药物。NKp 46在控制ZIKV感染和小鼠肿瘤中的体内作用 将通过比较病毒水平和肿瘤生长、NK细胞浸润（无和有化疗）来评估 在野生型和Ncr 1-nc/-nc小鼠中的肿瘤和存活率。

Natural killer cells (NK) act as a first line of defense against infection and cancer. NK activation is controlled by  a  balance  of  signals  transmitted  by  activating and  inhibitory  NK  receptors.  The  activating  receptor  NKp46  is  considered  the  major  activating  receptor  in  natural  cytotoxicity  against  autologous,  allogeneic  and  xenogeneic  target  cells.  NKp46  is  conserved  in  mammals  and  virtually  ubiquitously  expressed  on  NK,  suggesting  it  is  functionally  important.  Mice  deficient  in  Ncr1,  the  gene  encoding  NKp46,  are  impaired  in  tumor  immune  surveillance, have more severe influenza A, metapneumovirus, reovirus and fusobacterium infections and graft  versus  host  disease.  The  endogenous  ligand  of  this  important  activating  NK  receptor  is  not  known,  despite  decades  of  searching.  Our  preliminary  work  suggests  that  NKp46  recognizes  calreticulin  (CRT),  which  is  normally found inside the endoplasmic reticulum (ER) but gets transferred to the cell surface in ER-­stressed cells  or  tumor  cells  treated  with  some  cancer  drugs. An  NKp46-­Ig  fusion protein  specifically  pulls  down cell-­surface  CRT  (ecto-­CRT)  and  preliminary  data  using  surface  plasmon  resonance  indicate  specific  binding.  Knocking  down  CALR,  the  gene  encoding  for  CRT,  or  adding  blocking  antibodies  to  CRT  inhibits  NKp46-­mediated  NK  killing. Some chemotherapeutic agents and radiotherapy induce an immunostimulatory type of programmed cell  death  in  cancer  cells,  known  as  immunogenic  cell  death  (ICD),  which  removes  surviving  tumor  cells  after  treatment.  The  mechanism behind  ICD has been linked  to ecto-­CRT,  which  serves  as  an  “eat  me”/phagocytic  signal for dendritic cells, which then activate anti-­tumor CD8+ T cells by cross-­priming. Here we hypothesize that  NKp46 recognizes ecto-­CRT, and that NK recognition of ER-­stressed cells via NKp46 interaction with ecto-­CRT  plays an important role in ICD and NK-­mediated immune defense more generally. In preliminary data, infection  with ZIKV, which replicates in the ER and causes ER stress, and treatment of tumor  cell lines with ICD-­inducing  chemotherapy  drugs  induces  ecto-­CRT  and  NKp46-­dependent  NK  killing.  Moreover,  CRT-­coated  tumor  cells  become NK cell targets, and NCR1 knockout in an NK cell line strongly inhibits its killing of targets with exposed  CRT.  To  test  our  hypotheses,  we  will  first  confirm  that  ecto-­CRT  is  a  ligand  for  NKp46  by  using  biophysical  methods  to  characterize  ecto-­CRT  and  NKp46  binding  and  identifying  the  regions  of  CRT  responsible  for  the  interaction. Genetic  manipulation or  blocking of  NKp46 on  NK and of  ecto-­CRT  on tumor targets  will  examine  the role of this receptor-­ligand interaction in NK recognition, immune synapse formation and functional responses  to  infected  and  tumor  cells.  NK  killing  of  untreated  tumor  cells  and  tumor  cells  treated  with  ICD-­inducing  and  noninducing drugs will be compared. The in vivo role of NKp46 in controlling ZIKV infection and mouse tumors  (without and with chemotherapy) will be assessed by comparing viral levels and tumor growth, NK cell infiltration  of tumors and survival in wild-­type and Ncr1-­/-­ mice.