Chemical probing of conformation in large RNA molecules. Analysis of 16 S ribosomal RNA using diethylpyrocarbonate.
Chemical probing of conformation in large RNA molecules. Analysis of 16 S ribosomal RNA using diethylpyrocarbonate.
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大 RNA 分子构象的化学探测。
DOI：
10.1016/0022-2836(84)90435-2
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发表时间：
1984
影响因子：
5.6
通讯作者：
Noller,HF
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
VanStolk,BJ;Noller,HF
Peattie和吉尔伯特（1980）描述了一种基于碱基的化学修饰和苯胺诱导的链断裂来评估RNA中单个核苷酸构象的准确和快速的凝胶方法。为了将这种方法扩展到大RNA分子的分析，我们介绍了使用修饰的RNA与DNA限制性片段的杂交来产生确定长度的RNA片段。为了说明这种方法的实用性，我们用焦碳酸二乙酯探测了大肠杆菌16 S rRNA在“天然”条件下腺嘌呤残基的反应性。（80 mm-二甲胂酸钾（pH 7.0），20 mm-MgCl 2，300 mm-KCl）和“准二级”（80 mm-二甲胂酸钾（pH 7.0），1 mm-EDTA）条件。这项研究表明：（1）裸16 S rRNA中腺嘌呤残基的焦碳酸二乙酯反应性与基于比较序列分析的二级结构模型之间通常具有良好的一致性;在天然条件下探测的309个腺嘌呤残基中，仅在模型的螺旋中发现4个强反应性残基。(2)可能的三级相互作用的候选人被确定为腺嘌呤残基，在模型中是不成对的，在天然条件下对焦碳酸二乙酯不反应，但在准二级条件下反应。(3)在位置109和279之间的区域中已经鉴定出出乎意料的稳定结构，其中许多腺嘌呤残基甚至在90 °C下在80 mm-二甲胂酸钾、1 mm-EDTA中保持不反应。这可能对应于一个结构“核心”，这对核糖体组装的早期事件很重要。
Peattie & Gilbert (1980) have described an accurate and rapid gel method for assessing conformation of individual nucleotides in RNA, based on chemical modification of bases and aniline-induced strand scission. In order to extend this approach to analysis of large RNA molecules, we introduce the use of hybridization of modified RNA with DNA restriction fragments to generate RNA fragments of defined length. In principle, this permits chemical probing of conformation at any position of any RNA molecule for which a cloned DNA coding sequence is available.To illustrate the utility of this method, we use diethylpyrocarbonate to probe the reactivities of adenine residues inEscherichia coli16 S rRNA under “native” (80 mm-potassium cacodylate (pH 7.0), 20 mm-MgCl2, 300 mm-KCl) and “quasisecondary” (80 mm-potassium cacodylate (pH 7.0), 1 mm-EDTA) conditions. This study shows that: (1) there is generally good agreement between diethylpyrocarbonate reactivities of adenine residues in naked 16 S rRNA and a secondary structure model based on comparative sequence analysis; of 309 adenine residues probed under native conditions, only four strongly reactive residues are found in helices in the model. (2) Candidates for possible tertiary interactions are identified as adenine residues that are unpaired in the model and unreactive toward diethylpyrocarbonate under native conditions but reactive under quasi-secondary conditions. (3) An unexpectedly stable structure has been identified in the region between positions 109 and 279, where many adenine residues remain unreactive even at 90 °C in 80 mm-potassium cacodylate, 1 mm-EDTA. This may correspond to a structural “core” that is important for early events in ribosome assembly.
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