Molekulargenetische und biochemische Charakterisierung des pflanzlichen Mus81/Eme Endonuklease Komplexes

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Der Mus81/Eme Komplex spielt bei allen daraufhin untersuchten Eukaryonten in der DNA Reparatur und meiotischen Rekombination eine entscheidende Rolle. Wir konnten in Arabidopsis thaliana homologe Gene von MUS81 und EME identifizieren und deren Transkription nachweisen. Interessanterweise liegt das EME Gen im Arabidopsisgenom dupliziert vor (AtEME1, AtEME2; Proteinidentität 63%). In Voruntersuchungen konnten wir die endonukleolytische Aktivität eines heteromeren Komplexes aus Mus81/Eme1 von Arabidopsis in vitro nachweisen. Nun soll die biochemische Charakterisierung dieses Komplexes vorangetrieben und dabei im Vergleich zu Mus81/Eme2 die Substratspezifität beider Komplexe analysiert werden. Die Untersuchungen zur Substratspezifität sollen Aufschluss darüber geben, ob die Komplexe analog zu dem der Spalthefe spezifisch Holliday Junction (HJ)-Resolvaseaktivität oder eher wie in Bäckerhefe Endonukleaseaktivität aufweisen oder sich sogar untereinander in der Aktivität unterscheiden. Nachdem wir mehrere Insertions-mutanten von A. thaliana isoliert und bereits Hinweise auf genomische Instabilitäten im mutanten MUS81-Hintergrund erhalten haben, soll parallel die Funktion dieser Endonuklease in vivo geklärt werden. Dabei wird mit Hilfe von transgenen Testerlinien die Beteiligung der Endonuklease an verschiedenen Rekombinationswegen (extra-, intra- und interchromosomale sowie meiotische Rekombination) geprüft. Da AtEME1 und AtEME2 eng gekoppelt sind, sollen neben der Untersuchung an Insertionsmutanten der einzelnen Gene Pflanzen mit RNA-Interferenz Konstrukten hergestellt und untersucht werden, bei denen die Expression beider EME-Gene ausgeschaltet ist. Schließlich soll mittels biochemischer und genetischer Ansätze versucht werden Interaktionen der Endonuklease-Komplexe mit anderen in DNA-Rekombinationsprozesse involvierten Proteinen, wie zum Beispiel den RecQ-Helikasen, nachzuweisen.