Regulation des Phosphoinositmetabolismus und der Clathrin-abhängigen Endozytose an chemischen Synapsen

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Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphospat(PIP2) reguliert u.a. Membrantransportvorgänge wie die Clathrin-vermittelte Endozytose und das exo-endozytotische Recycling synaptischer Vesikel. Dabei unterliegt der Phosphoinositmetabolismus der regulatorischen Kontrolle FP2- metabolisierender Enzyme wie der Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase (PIPK) sowie der Phosphoinositolphosphat-Phosphatase Synaptojanin. Jüngste Studien konnten zeigen, dass aktivitätsabhängige Änderungen im exo-endozytotischen Recycling synaptischer Vesikel mit erhöhten PIP2-Konzentrationen im präsynaptischen Kompartiment einhergehen. Dabei sowohl regulatorische Protein-Protein-Wechselwirkungen als auch NMDA-Rezeptor-induzierte NO/ cGMPabhängige retrograde Signalkaskaden von besonderer Bedeutung zu sein. Im Rahmen dieses Projektes sollen molekulare Mechanismen der Regulation des Phosphoinositmetabolismus und sowie deren Auswirkungen auf das Recycling synaptischer Vesikel untersucht werden. So soll die Interaktion der PIPK mit Arf6 und AP-2 molekular charakterisiert und zur Erzeugung interaktionsdefizienter Mutanten genutzt werden. Ferner sollen die Effekte von NO und cGMP auf die Aktivität, den Phosphorylierungsstatus und die subzelluläre Lokalisation der FP2- metabolisierenden Enzyme PIPK Typly und Synaptojanin getestet werden. Dies beinhaltet Studien zur Regulation und Aktivität o.g. Phosphoinositlipid-metabolisierender Enzyme als auch deren Bindung an Regulatorproteine wie Arf6, Talin, AP-2 oder Endophilin. Posttranslationale Modifikationen dieser Enzyme und ihrer Bindungspartner können über moderne massenspktrometrische Verfahren aufgeklärt und hernach funktionell charakterisiert werden. Wir planen ferner prä- und postsynaptische Zielproteine von NO und cGMP mittels cGMP- und Phosphoprotein- Affinitätschromatographie, 2D-Gel und MS Analyse, und subcellular Proteomics1 biochemisch zu identifizieren und funktioneil zu charakterisieren. Um Änderungen der FP2-Konzentrationen in lebenden Zellen zu verfolgen, soll ein FRET-basierter Lebendzell-Assay etabliert werden. Schließlich ist vorgesehen, die funktioneile Bedeutung NO-induzierter Änderungen des FP2-Metabolismus und der daran beteiligten Effektorproteine durch Kombination pharmakologischer (NO-Donor, NO-Scavenger, Guanylyl-Zyklase-Inhibitoren), zellbiologischer (Recycling- und Lokalisationsstudien Studien in transfizierten Primärkultur-Neuronen), biochemischer (Applikation TAT-peptidtransduzierter Inhibitorproteine in Synaptosomen), und optischer Methoden (FM Farbstoff Recycling, PH-EGFP-Lebendzellmikroskopie & FRET) in Synaptosomen und lebenden Neuronen zu untersuchen.