Funktionelle Charakterisierung der Adaptorproteine Stonin 1 und gamma-BAR beim intrazellulären Membrantransport

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Intrazellulärer Membrantransport erfordert die Wechselwirkung von Adaptorproteinen mit Membran-Cargoproteinen und deren Sortierung in Transportvesikel. Von besonderer Bedeutung sind diese Prozesse in Neuronen, wo distinkte Membrandomänen, die axonale und die somatodendritische Plasmamembran, in der Trennung ein- und ausgehender Signale während der neuronalen Reizleitung impliziert sind. So sind in den vergangenen Jahren neue akzessorische Adaptorproteine wie Stonin 1 und 2, 2C18, HIP1, ARH, Hrs etc. identifiziert worden, welche spezialisierte Funktionen bei der Erkennung und Sortierung von Membranproteinen übernehmen. In dem vorgeschlagenen Projekt planen wir, durch Kombination molekulargenetischer, zellbiologischer und biochemischer Ansätze Einblicke in die Funktion der monomeren Adaptorproteine Stonin 1 und 2C18 im intrazellulären Membrantransport sowie der polaren Sortierung von Proteinen in Neuronen zu untersuchen. So sollen einerseits neue Interaktionspartner von Stonin 1 und 2C18 durch Hefe 2-Hybrid-Screens, Affinitätschromatographie und Ko-Immunpräzipitationsexperimente in Kombination mit RNA-Interferenz-Verfahren identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Wir möchten darüberhinaus Einblicke in die putative Funktion dieser Adaptorproteine bei der intrazellulären Sortierung von Membran-assoziierten Proteinen gewinnen. Dazu sollen die physiologischen Effekte eines durch RNA-Interferenz induzierten Expressionsverlustes ('knockdown') von Stonin 1 oder 2C18 auf die Internalisierung und den intrazellulären Transport von Plasmamembran-Rezeptoren und axonalen Membranproteinen studiert werden. Ergänzend planen wir durch Isolierung und Charakterisierung von Transportvesikeln zusätzliche Einblicke in Stonin 1 bzw. 2C18-vermittelte Sortierungsvorgänge zu gewinnen. Schließlich möchten wir durch Erzeugung induzierbarer Knock-out Mauslinien die physiologische Rolle von Stonin 1 und 2C18 im organismischen Kontext sowie auf der zellulären Ebene untersuchen. Zur phänotypischen Analyse der erhaltenen Knockout-Mäuse sollen dann sowohl biochemische und zellbiologische Methoden, als auch elektrophysiologische Verfahren angewandt werden. Wir erwarten, dass die vorgeschlagenen Untersuchungen zu unserem grundlegenden Verständnis des polarisierten Membrantransportes insbesondere in Neuronen beitragen werden.