Investigation and optimization of microbial strains expressing human CYP450 genes for drug metabolism studies and drug metabolite production

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Bei der Medikamentenentwicklung sind effiziente Strategien für ein metabolisches und toxikologisches Screening sowie die Produktion von neuen Ausgangsverbindungen und Arzneistoffderivaten für vor-klinische und klinische Studien im Grammmaßstab von hoher Wichtigkeit. Um die Rolle von verschiedenen Säugetier-Cytochrom P450 Enzymen (CYP450) bei der Arzneistoffderivatisierung zu untersuchen, werden häufig rekombinante Biokatalysesysteme angewendet. Aufgrund der komplexen Natur und Organisation dieser Klasse von Enzymen ist die Verwendung von Ganzzell-Biokatalysatoren von Vorteil, um Medikamentenderivatisierungsstudien durchzuführen und Arzneistoffe und deren Derivate zu produzieren. Allerdings kranken die derzeit verfügbaren Systeme vor allem an geringen Aktivitäten und Stabilitäten. Deshalb ist es wichtig, stabilere und effizientere mikrobielle Stämme für CYP450-katalysierte Biotransformationen zu entwickeln. Das primäre Ziel dieses Forschungsprojektes ist es daher, die Faktoren, die die katalytische Effizienz von CYP450-Enzymen in rekombinanten Mikroorganismen limitieren, zu finden und zu untersuchen. Auf der Basis des so generierten Wissens soll die Optimierung von mikrobiellen Ganzzellsystemen hin zu kontrollierbaren und effektiven Biokatalysatoren angegangen werden. Das Fernziel ist die Entwicklung von Katalysatoren zur Produktion von Arzneistoffen und ihren Derivaten im Grammmaßstab sowie zur Untersuchung der Wirkstoffderivatisierung durch CYP450-Enzyme aus der menschlichen Leber.Die Charakterisierung von rekombinanten Ganzzellbiokatalysatoren bedingt dabei eine sensitive und selektive Methode zur Identifizierung und Quantifizierung der eingesetzten Säugetier-CYP450-Enzyme. Aufgrund signifikanter Limitationen insbesondere bezüglich Sensitivität und Selektivität sind die heute bestehenden Methoden dafür nicht geeignet Die Anwendung zuverlässiger und hoch sensitiver sowie selektiver Massenspektrometrie (MS)-basierter Strategien stellt diesbezüglich eine vielversprechende Alternative dar. In diesem Gemeinschaftsprojekt soll eine solche Methodik für die Charakterisierung von Ganzzellbiokatalysatoren adaptiert und eingesetzt werden. Konkret wird dabei eine MS-basierte Identifizierung und absolute Quantifizierung von Säugetier-CYP450-Enzymen direkt mit der Optimierung von rekombinanten mikrobiellen Stämmen zur CYP450-Expression und -Katalyse gekoppelt. Dieser Ansatz wird Verbesserungen bezüglich Aktivität, Spezifität und Stabilität sowie Wirtsselektion und Reaktionsbedingungen erlauben.