Functional analysis of Hammerhead Ribozymes from plants

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Das Hammerhead Ribozyme (HHRz) ist ein kleines RNA Motiv mit spezifischer Spaltungsund Ligationsaktivität, die von zweiwertigen Metallionen abhängt. Wir haben diese Motive in A. thaliana als erstem Pflanzengenom gefunden und Expression und Spaltung in mehreren Geweben gezeigt. In diesem Projekt wollen wir diese HHRzs detailliert biochemisch und funktioneil untersuchen. Thermodynamische Parameter and die Stöchiometrie der Mg2+ Bindung sollen durch Kalorimetrie bestimmt werden, und mit HHRzs aus Viroiden vergleichen werden, um Unterschiede in der Aktivität zu erklären. Wir haben Spaltung in Viroid Varianten gezeigt, obwohl diese nicht den publizierten Sequenzanforderungen genügen. Diese Varianten sollen zusätzlich kinetisch charakterisiert, und ihre Metallionen Bindung untersucht werden. Die Arabidopsis HHRzs sollen auf subzelluläre Lokalisation, Gewebespezifität und eine Regulation ihrer Expression durch Licht untersucht werden. Dies soll mit der Expression der putativen Ziel mRNA verglichen werden, gegen die die HHRzs in antisense Orientierung liegen. In vivo Analysen, z.B. Knock-down durch siRNAs und Herstellung homozygoter Knock-out Linien, werden im kooperierenden Labor von D. Staiger durchgeführt. Schließlich soll der evolutionäre Ursprung der Pflanzen HHRz durch Southern Blot Analysen an einer Vielzahl an Genomen untersucht werden. Sequenzen aus neuen Pflanzen sollen kloniert und in vitro charakterisiert werden.