significance and mechanism of parasitoid killing factors horizontally transmitted between insects and viruses

１-１） PKF のタンパク質発現と抗体作製：　バキュロウイルス由来のタンパク質発現ベクターを用いてPKFを発現させた。複数のベクターと大腸菌株の組み合わせを用いて、PKFの発現を試みた結果、PKFを多量に発現させる大腸菌とベクターの組み合わせを特定した。大腸菌で発現させたタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出したが、不溶性のタンパク質になったので、可溶化する方法を検討する必要がある。また、C末側のペプチドを合成して抗体を作成した。また、in vitro translationを用いたタンパク質発現を試みた。１-２）　PKF欠損ウイルスの確立：　野生株のMySEVがそれぞれ感染した感受性細胞にトランスファーベクター（PKF 遺伝子にマーカー遺伝子を組換える）をトランスフェクションさせた。相同組換えによりPKF 遺伝子を欠損させたウイルス株をマーカー遺伝子の検出によりクローニングした（高務担当）。構築したPKF欠損MySEV株ついて東京農工大学で生物検定を行うために文部科学大臣確認実験の申請を行った。1-3） シロイチモジヨトウを用いたゲノム編集技術の確立：　PKFをゲノムに持つシロイチモジヨトウについて、ゲノム編集技術を用いてPKF遺伝子の欠損を行った。まず、シロイチモジヨトウのゲノムを解析した結果、PKF２遺伝子が日本のシロイチモジヨトウでは欠損していることが明らかになった。次に、Cryspr-Cas９システムによりPKF1遺伝子を欠損昆虫を作製した。最終的に、PKF1遺伝子を欠損した昆虫の作製に成功した（伊藤仲井担当）。

１-１） PKF のタンパク質発現と抗体作製：　バキュロウイルス由来のタンパク質発現ベクターを用いてPKFを発現させた。複数のベクターと大腸菌株の組み合わせを用いて、PKFの発現を試みた結果、PKFを多量に発現させる大腸菌とベクターの組み合わせを特定した。大腸菌で発現させたタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出したが、不溶性のタンパク質になったので、可溶化する方法を検討する必要がある。また、C末側のペプチドを合成して抗体を作成した。また、in vitro translationを用いたタンパク質発現を試みた。１-２）　PKF欠損ウイルスの確立：　野生株のMySEVがそれぞれ感染した感受性細胞にトランスファーベクター（PKF 遺伝子にマーカー遺伝子を組換える）をトランスフェクションさせた。相同組換えによりPKF 遺伝子を欠損させたウイルス株をマーカー遺伝子の検出によりクローニングした（高務担当）。構築したPKF欠損MySEV株ついて東京農工大学で生物検定を行うために文部科学大臣確認実験の申請を行った。1-3） シロイチモジヨトウを用いたゲノム編集技術の確立：　PKFをゲノムに持つシロイチモジヨトウについて、ゲノム編集技術を用いてPKF遺伝子の欠損を行った。まず、シロイチモジヨトウのゲノムを解析した結果、PKF２遺伝子が日本のシロイチモジヨトウでは欠損していることが明らかになった。次に、Cryspr-Cas９システムによりPKF1遺伝子を欠損昆虫を作製した。最終的に、PKF1遺伝子を欠損した昆虫の作製に成功した（伊藤仲井担当）。