in vivo CRISPRスクリーニングの技術確立と生体内細胞増殖機構の解析

体内CRISPR筛选技术建立及体内细胞增殖机制分析

• 批准号: 21H04959
• 负责人: 遊佐 宏介
• 金额: $ 26.71万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-05 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H04959/
• 关键词: CRISPR-Cas9; Genetic screening; Leukemia; in vivo model; ゲノム編集; Flp; スクリーニング; T-ALL; in vivo CRISPRスクリーニング; 多発性骨髄腫; 増殖必須因子; 分子標的; Cre

マウス遺伝学において時空間特異的遺伝子破壊のために一般的に用いられるCre-loxPシステムであるが、ヒト細胞においては予想以上の高い細胞毒性が見られ、本システムによる遺伝子発現制御は困難であった。その代替法として、Creとは異なる配列を認識する同様の部位特異的組換えシステムvCre-vlox及びFlp-FRTを検討した。結果、vCreは毒性を示した一方、Flpは毒性を示さなかったことからFlp-FRTシステムが有効であることがわかった。組換え効率は最大80%程度であったが、スクリーニングは実施可能と判断した。多発性骨髄腫が骨髄にとどまる機構の重要なものの一つはCXCR4-CXCL12の相互作用であり、in vivoスクリーニングではこの相互作用に関わる因子もヒットすると考えられる。そこで、in vitroケモタキシスアッセイを用いてCXCR4-CXCL12相互作用にかかわる因子をゲノムワイドCRISPRスクリーニングで同定することとした。アッセイにはこの実験系で実績のあるT細胞急性リンパ性白血病細胞(T-ALL)株を用いた。スクリーニングの結果、既知の細胞運動にかかわる因子の他に、クロマチン制御因子を得た。分子メカニズム解析の結果、クロマチン制御因子はT-ALLで重要な転写因子RUNX1のゲノムへの結合に必須であり、クロマチン制御因子の活性を阻害するとRUNX1の下流遺伝子の発現が有意に低下することが明らかとなった。下流遺伝子にはCXCR4があり、その発現が低下することでCXCL12に対するケモタキシス活性が低下することがわかった。RUNX1の下流にはT-ALLの増殖に必須の遺伝子群もあり、これらの遺伝子も発現低下することで抗腫瘍効果が発揮される。このことより、クロマチン制御因子がT-ALLの治療標的となることが明らかとなった。

マ ウ ス heritage 伝 learn に お い て in space specific heritage 伝 son broken 壊 の た め に general に with い ら れ る Cre - loxP シ ス テ ム で あ る が, ヒ ト cells に お い て は to want to see high above の い cell toxicity が ら れ, this シ ス テ ム に よ る heritage 伝 son 発 now suppression は difficult で あ っ た. そ の instead of law と し て, Cre と は different な る match column を know す る with others の site specific group change え シ ス テ ム vCre - vlox and び - FRT Flp を beg し 検 た. Results, vCre を は toxicity in し た side and toxic を は Flp さ な か っ た こ と か ら - FRT Flp シ ス テ ム が have sharper で あ る こ と が わ か っ た. The maximum 80% degree of the え efficiency of the group conversion であったが, the ス リ リ ニ ニ <s:1> グ グ グ practical possibility と to determine the た た. Multiple 発 bone marrow swollen が bone marrow に と ど ま る institutions の important な も の の a つ は CXCR4 - CXCL12 の interaction で あ り, the in vivo ス ク リ ー ニ ン グ で は こ の interaction に masato わ る factor も ヒ ッ ト す る と exam え ら れ る. そ こ で, the in vitro ケ モ タ キ シ ス ア ッ セ イ を with い て CXCR4 - CXCL12 interaction に か か わ る factor を ゲ ノ ム ワ イ ド CRISPR ス ク リ ー ニ ン グ で with fixed す る こ と と し た. Youdaoplaceholder0 に に <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> た laboratory で ある t-cell acute リ パ パ leukemia cell (T-ALL) line を using を た た. ス ク リ ー ニ ン グ の results, both known の cell movement に か か わ る factor の he に, ク ロ マ チ ン た を suppression factor. Molecular メ カ ニ ズ ム analytical の results, ク ロ マ チ ン suppression factor は T - ALL important な で planning write factor RUNX1 の ゲ ノ ム へ の must combine に で あ り, ク ロ マ チ ン suppression factor の activity を resistance against す る と RUNX1 の dirty legacy 伝 son の 発 が now intends to low に す る こ と が Ming ら か と な っ た. Dirty legacy 伝 son に は CXCR4 が あ り, そ の 発 now low が す る こ と で CXCL12 に す seaborne る ケ モ タ キ シ ス active low が す る こ と が わ か っ た. RUNX1 の obscene に は T - ALL の raised colonization に must の heritage 伝 subgroup も あ り, こ れ ら の heritage 伝 son も 発 now low す る こ と で resistance swollen sores unseen fruit が 発 swing さ れ る. <s:1> <s:1> とよ, ロ ロ チ チ, <s:1> control factor がT-ALL <s:1> therapeutic target となる とが とが prescription ら となった となった.

项目成果

Development and Applications of CRISPR-KO Screening

CRISPR-KO筛选的发展及应用

• 发表时间: 2022
• 作者: Makoto Oba;Mika Shibuya;Yuto Yamaberi;Hidetomo Yokoo;Satoshi Uchida;Atsushi Ueda;Masakazu Tanaka;加納英明;遊佐宏介
• 通讯作者: 遊佐宏介

Wellcome Ssanger Institute/University of Cambridge/Wellcome Trust-MRC Stem Cell Institute(英国)

Wellcome Ssanger 研究所/剑桥大学/Wellcome Trust-MRC 干细胞研究所（英国）

Development and Application of CRISPR-KO Screening

CRISPR-KO筛选的开发及应用

• 发表时间: 2021
• 作者: Hideaki Kano;Philippe Leproux;遊佐宏介
• 通讯作者: 遊佐宏介

Development of CRISPR-KO Screening and its Applications in Cancer Research

CRISPR-KO筛选的发展及其在癌症研究中的应用

• 发表时间: 2022
• 作者: 遊佐宏介

CRISPR-KO スクリーニングの開発と応用

CRISPR-KO筛选的开发及应用

• 发表时间: 2022
• 作者: 岡田初美;古島理恵;京田耕司;大浪修一;遊佐宏介
• 通讯作者: 遊佐宏介