in vivo CRISPRスクリーニングの技術確立と生体内細胞増殖機構の解析

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マウス遺伝学において時空間特異的遺伝子破壊のために一般的に用いられるCre-loxPシステムであるが、ヒト細胞においては予想以上の高い細胞毒性が見られ、本システムによる遺伝子発現制御は困難であった。その代替法として、Creとは異なる配列を認識する同様の部位特異的組換えシステムvCre-vlox及びFlp-FRTを検討した。結果、vCreは毒性を示した一方、Flpは毒性を示さなかったことからFlp-FRTシステムが有効であることがわかった。組換え効率は最大80%程度であったが、スクリーニングは実施可能と判断した。多発性骨髄腫が骨髄にとどまる機構の重要なものの一つはCXCR4-CXCL12の相互作用であり、in vivoスクリーニングではこの相互作用に関わる因子もヒットすると考えられる。そこで、in vitroケモタキシスアッセイを用いてCXCR4-CXCL12相互作用にかかわる因子をゲノムワイドCRISPRスクリーニングで同定することとした。アッセイにはこの実験系で実績のあるT細胞急性リンパ性白血病細胞(T-ALL)株を用いた。スクリーニングの結果、既知の細胞運動にかかわる因子の他に、クロマチン制御因子を得た。分子メカニズム解析の結果、クロマチン制御因子はT-ALLで重要な転写因子RUNX1のゲノムへの結合に必須であり、クロマチン制御因子の活性を阻害するとRUNX1の下流遺伝子の発現が有意に低下することが明らかとなった。下流遺伝子にはCXCR4があり、その発現が低下することでCXCL12に対するケモタキシス活性が低下することがわかった。RUNX1の下流にはT-ALLの増殖に必須の遺伝子群もあり、これらの遺伝子も発現低下することで抗腫瘍効果が発揮される。このことより、クロマチン制御因子がT-ALLの治療標的となることが明らかとなった。