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クローン性造血関連遺伝子変異特異的な自己複製亢進を誘導する骨髄微小環境の解明

阐明诱导克隆造血相关基因突变特异性自我更新增强的骨髓微环境

基本信息

批准号：
21J11016
负责人：
城下郊平
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J11016/
关键词：
造血幹細胞遺伝子編集静止期 CRISPR-Cas9 静止期維持培養

项目摘要

まず造血幹細胞(HSC)に最適化した遺伝子編集法の確立に取り組んだ。高サイトカイン・長時間の遺伝子編集前培養がRNPの核内移行性を改善し、遺伝子編集効率を向上させることを見出した。遺伝子編集後培養ではなく、遺伝子編集前培養が遺伝子編集効率を規定することを明らかにした。次に遺伝子編集後HSCの再静止期化を試みた。遺伝子編集後HSCを高アルブミン・低酸素・低サイトカインで規定される静止期維持培養環境で培養した。編集前培養で刺激され活性化状態にあった遺伝子編集HSCが7日間かけて再度静止期に戻ることを見出した。静止期維持培養後の遺伝子編集HSCは、古典的な増殖培養後の遺伝子編集HSCに比べて、新鮮HSCに類似した細胞表面マーカータイプ・遺伝子発現プロファイルを有していた。さらに競合的骨髄移植を行ったところ、増殖培養群に比べて高い移植後生着能・再構築能を維持していた。遺伝子編集後HSCの静止期再獲得という現象は、アデノ随伴ウィルス(AAV)を用いた相同修復(HDR)とヒト臍帯血HSCを用いた非相同末端結合(NHEJ)でも確認され、遺伝子編集後の培養条件を調節することで、HSCの細胞周期を体外で制御できることが明らかとなった。これまでHSCの静止期性(quiescence)の解析には主にマウスモデルが用いられてきたが、対象となる遺伝子数に制限があることやマウスモデルの樹立まで時間を要すること、さらにヒトへの応用性などの問題点があった。本研究で確立した遺伝子編集・培養プラットフォームはHSCの静止期性研究において有用な解析ツールとなりうる。この遺伝子編集プラットフォームを用いて、クローン性造血(CHIP)関連遺伝子変異を導入したHSCの動態を解析したところ、7日間という短期間では有意な差は見られず、今後培養環境の最適化や培養期間の延長などが必要である。

Establishment of optimal genetic assembly methods for hematopoietic stem cells (HSC) The high level of gene expression and the high level of gene expression in pre-compilation culture have improved the nuclear migration of RNP, and the gene expression rate has increased. After the compilation of genetic information, culture, genetic information before the compilation of genetic information, the compilation rate of genetic information is regulated. After the compilation of the second generation, HSC was re-quiesced. HSC is cultured in a static culture environment with a high level of protein and a low level of protein. Before compilation, the stimulation and activation state of HSC were observed. HSC after stationary maintenance culture, HSC after classical propagation culture, HSC after fresh HSC, HSC after static maintenance culture, HSC after classical propagation culture, HSC after static maintenance culture, HSC, HSC, HSC after static maintenance culture, HSC, HSC, HSC after static maintenance culture, HSC, HSC, HSC In addition, the ability to reproduce and reconstruct bone marrow cells in vitro was also maintained. Re-acquisition of HSC at quiescent stage after gene assembly is a phenomenon identified by the regulation of culture conditions after gene assembly, and the control of HSC cell cycle in vitro. The quiescence analysis of HSC is mainly based on the limitation of the number of pixels in the image, and the establishment time of the image. This study established a useful analysis method for the static phase study of HSC. The analysis of HSC dynamics and the optimization of culture environment and the extension of culture period are necessary in the future.