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Photoswiching system for targeted DNA demethylation using photoreceptor-fused methylcytosine dioxygenase

使用光感受器融合甲基胞嘧啶双加氧酶进行靶向 DNA 去甲基化的光交换系统

基本信息

批准号：
21J14414
负责人：
高夏海
金额：
$ 0.51万
依托单位：
Tokyo University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J14414/
关键词：
DNAメチル化 DNA脱メチル化

项目摘要

本研究は光照射によって組織特異的に標的遺伝子の脱メチル化を制御する方法を開発することを目的とした。遺伝子のプロモーター領域がメチル化されると遺伝子発現が抑制され、脱メチル化されると遺伝子発現が亢進される。一方、がん細胞ではDNAメチル化異常が生じており、がん遺伝子とがん抑制遺伝子のプロモーター領域がそれぞれ低メチル化、高メチル化状態であることが報告されている。つまり、特定遺伝子のメチル化状態を制御することは新規がん治療法の開発に繋がる。そこで本研究では青色光を照射することにより、2量体を形成する光受容体蛋白質Vividと、DNAの特定領域を認識するTALE (Transcription-activator-like effector)蛋白質、2量体化することで機能する分割型のメチルシトシン酸化酵素TETを組み合わせれば、光照射した細胞のみ、遺伝子特異的にDNA脱メチル化を引き起こす融合蛋白質を作製することができると想定した。標的配列中のメチルシトシンが脱メチル化されるとヒドロキシメチルシトシンが生じる。そのため、実際に本融合蛋白質によって脱メチル化されたか確認するために、ヒドロキシメチル化CpG結合蛋白質Ubiquitin like with PHD and Ring Finger Domains 2 (UHRF2)のSET and RING Associated (SRA) domainにFirefly luciferaseを融合させた蛋白質を用いたヒドロキシメチル化レベル測定法を開発した。さらに、TET-Vivid-TALE発現ベクターとTET-Vivid発現ベクターの2つの哺乳類細胞発現ベクターの構築法を確立した。今後、これらの発現ベクターを用いれば、青色光照射下において標的遺伝子特異的な脱メチル化法が確立できると期待される。

The aim of this study is to develop a method for the control of tissue-specific target proteins by light irradiation. The development of the gene is inhibited, deregulated, and enhanced in the field of gene expression. One side, the cell DNA is abnormal, the cell DNA is abnormal. The development of new therapeutic methods is controlled by the control of the state of specific genes. In this study, we studied the effects of cyan light on protein Vivid and DNA in vivo.(Transcription-activator-like effector) protein, 2-dimensional characterization, functional characterization, fragmentation, enzyme assembly, light irradiation, cell culture, gene-specific DNA fragmentation, fusion protein production, and so on. In the target arrangement, the number of items in the list will be reduced to zero. The fusion protein Ubiquitin like with PHD and Ring Finger Domains 2 (UHRF2) and SET and Ring Associated (SRA) domain Firefly luciferase fusion protein Ubiquitin like with PHD and Ring Finger Domains 2 (UHRF2) was developed using the Ubiquitin assay. In addition, TET-Vivid-TALE development strategy and TET-Vivid-TALE development strategy were established. In the future, the development of new technologies will be carried out under the irradiation of cyan light, and the development of new technologies will be expected.