人工脂質膜を反応場とした難溶性膜タンパク質完全化学合成法の開発研究

本研究では、脂質ナノディスクを反応場とする膜タンパク質化学合成に向けた基盤技術の確立を目的としている。生体内機能解析に向けた分子多様性拡大の観点からも、膜タンパク質化学合成は達成すべき課題であるが、膜タンパク質を構成するペプチドフラグメントの水系溶媒への難溶性が化学合成を阻んでいる。すなわち、膜貫通フラグメントが水系溶媒に溶解せず、タンパク質化学合成に不可欠のNative Chemical Ligation (NCL) 法による縮合及びその連続化が不可能である点が克服すべき課題である。前年度までに申請者は、脂質ナノディスク導入型膜貫通フラグメントと細胞内および細胞外フラグメントを用いた連続的NCL反応により、一回膜貫通タンパク質であるインフルエンザM2タンパク質の化学合成に成功している。そこで今年度は、本手法を発展させ、複数回膜貫通タンパク質化学合成に向けた検討を行った。申請書で示した、脂質ナノディスク間でのNCLを行う戦略では複数回膜貫通タンパク質の合成は達成できなかった。そこでM2タンパク質合成時に得られた、pH依存的な脂質ナノディスク崩壊に伴う脂質―ペプチド複合体への変換現象を利用する戦略を立てた。脂質ナノディスク崩壊条件等について種々検討を行ったところ、NCLに用いるチオール触媒存在下酸性条件にて膜貫通フラグメント導入型脂質ナノディスクの崩壊とともに脂質―ペプチド複合体に変換され、複合体中でNCLが進行することを明らかにした。さらに、本現象を用いることでモデル検討ながら二回膜貫通タンパク質の合成に成功した。

本研究では、脂質ナノディスクを反応場とする膜タンパク質化学合成に向けた基盤技術の確立を目的としている。生体内機能解析に向けた分子多様性拡大の観点からも、膜タンパク質化学合成は達成すべき課題であるが、膜タンパク質を構成するペプチドフラグメントの水系溶媒への難溶性が化学合成を阻んでいる。すなわち、膜貫通フラグメントが水系溶媒に溶解せず、タンパク質化学合成に不可欠のNative Chemical Ligation (NCL) 法による縮合及びその連続化が不可能である点が克服すべき課題である。前年度までに申請者は、脂質ナノディスク導入型膜貫通フラグメントと細胞内および細胞外フラグメントを用いた連続的NCL反応により、一回膜貫通タンパク質であるインフルエンザM2タンパク質の化学合成に成功している。そこで今年度は、本手法を発展させ、複数回膜貫通タンパク質化学合成に向けた検討を行った。申請書で示した、脂質ナノディスク間でのNCLを行う戦略では複数回膜貫通タンパク質の合成は達成できなかった。そこでM2タンパク質合成時に得られた、pH依存的な脂質ナノディスク崩壊に伴う脂質―ペプチド複合体への変換現象を利用する戦略を立てた。脂質ナノディスク崩壊条件等について種々検討を行ったところ、NCLに用いるチオール触媒存在下酸性条件にて膜貫通フラグメント導入型脂質ナノディスクの崩壊とともに脂質―ペプチド複合体に変換され、複合体中でNCLが進行することを明らかにした。さらに、本現象を用いることでモデル検討ながら二回膜貫通タンパク質の合成に成功した。