Research for the three-dimensional culture of porcine spermatogonial stem cells (SSCs) and the perfusion organ culture of testicular organoids.

本研究は単離したブタのセルトリ細胞と精子幹細胞を、人為的に３次元的な精細管環境を再現することにより、幹細胞ニッチを再構築し、体外で幹細胞を増殖させることを目的とする。2022年度は以下のことを明らかにした。1.ブタ精巣からのセルトリ細胞の単離方法の再検討昨年度から課題であった精巣からのセルトリ細胞の単離が予想以上に困難であった。幼若期から成熟期まで利用できる細胞表面マーカーが無く、しかも高純度でより多くのセルトリ細胞を必要とするためである。そこでOptiPrep密度勾配遠心法を用いて分画精度とスケールアップを中心に検討を行った。まず精巣より生存率の高い採取法と採取した細胞懸濁液からの死細胞除去の必要性を明らかにした。分画精度を上げるために、OptiPrepの密度勾配を非連続密度勾配から連続密度勾配に変更し、より短時間で容易に勾配層を作れる手法を確立した。密度勾配遠心後の細胞の回収には、ステッピングモーターを用いた細胞層の採取とCNCフライス盤を活用した24well培養皿フラクションコレクターの自作により実施できるようにした。これらの再検討により純度の高いより多くの細胞を取り扱えるようになった。2微小ペリスタポンプを用いた灌流器官培養装置の改良昨年度に作製した灌流器官培養装置をさらに小型化してより多くの灌流装置を一度に培養できる装置に改良した。また通気性EVAフィルムは滅菌方法に難点があったため、高圧滅菌操作に耐えうるフィルムを入手するとともに、培養装置に組み込んだ。精巣より精細管のみを採取し、同装置で精細管の器官培養条件について検討を行った。さらに3Dプリンターの活用により、作製した部品を鋳型に高圧滅菌可能な資材に変更することでコンタミの頻度を低減することが出来た。

本研究は単離したブタのセルトリ細胞と精子幹細胞を、人為的に３次元的な精細管環境を再現することにより、幹細胞ニッチを再構築し、体外で幹細胞を増殖させることを目的とする。2022年度は以下のことを明らかにした。1.ブタ精巣からのセルトリ細胞の単離方法の再検討昨年度から課題であった精巣からのセルトリ細胞の単離が予想以上に困難であった。幼若期から成熟期まで利用できる細胞表面マーカーが無く、しかも高純度でより多くのセルトリ細胞を必要とするためである。そこでOptiPrep密度勾配遠心法を用いて分画精度とスケールアップを中心に検討を行った。まず精巣より生存率の高い採取法と採取した細胞懸濁液からの死細胞除去の必要性を明らかにした。分画精度を上げるために、OptiPrepの密度勾配を非連続密度勾配から連続密度勾配に変更し、より短時間で容易に勾配層を作れる手法を確立した。密度勾配遠心後の細胞の回収には、ステッピングモーターを用いた細胞層の採取とCNCフライス盤を活用した24well培養皿フラクションコレクターの自作により実施できるようにした。これらの再検討により純度の高いより多くの細胞を取り扱えるようになった。2微小ペリスタポンプを用いた灌流器官培養装置の改良昨年度に作製した灌流器官培養装置をさらに小型化してより多くの灌流装置を一度に培養できる装置に改良した。また通気性EVAフィルムは滅菌方法に難点があったため、高圧滅菌操作に耐えうるフィルムを入手するとともに、培養装置に組み込んだ。精巣より精細管のみを採取し、同装置で精細管の器官培養条件について検討を行った。さらに3Dプリンターの活用により、作製した部品を鋳型に高圧滅菌可能な資材に変更することでコンタミの頻度を低減することが出来た。