トランスゴルジネットワーク上で制御される新規なエンドソーム形成機構の解明

阐明跨高尔基体网络调节的新型内体形成机制

基本信息

批准号：
21K06157
负责人：
長野真
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、(1) Rab5特異的なGFEFであるVps9pの結合因子の探索、(2) Pik1p/Rab11/GGAsによるRab5活性化のメカニズム、および(3) Arf1pと独立してRab5の活性化を制御する因子の探索を進めた。(1)では、GST-Vps9pをbaitとして、出芽酵母のタンパク質抽出液からVps9p結合因子の単離を試みた。まず、大腸菌リコンビナントでGST-Vps9pを発現・精製する実験系を導入し、完了した。続いて、得られたGST-Vps9p用いて、プルダウン法で結合タンパク質の精製を行った。現在のところ、コントロールとしておいたGSTのプルダウンフラクションと比較して、SDS-PAGE上、GST-Vps9pで特異的なバンドは得られていない。次年度は、精製法の改善を図る。(2)では、3つの因子について、単独あるいは複数組み合わせで、機能欠損株を作製し、Rab5ホモログVps21pの活性化レベルを解析した。この結果、Pik1p単独の機能欠損株では、野生株と比較して80%以上の活性化レベルであり、単独では大きな影響を与えないことを明らかとした。次に。複数組み合わせて機能欠損株を解析したところ、Pik1/Rab11の機能欠損株で60%程度、Pik1/Rab11/GGAsの機能欠損株で10%まで低下することを見出した。これら以外の組み合わせでも同様に検討し、Pik1、Rab11、GGAsがそれぞれ独立してRab5活性化に関与することが明らかとなった。これらの研究結果を含め、学術論文に投稿し、現在査読中である。(3)では、ゴルジ/TGNに局在するタンパク質の中で、その遺伝子欠損によって、エンドソーム輸送前後のステップでエンドーリソソーム輸送が異常となるものに注目し、ARF1との二重欠損株を作製し、GFP-Vps21pのエンドソーム輸送への影響を解析した。

今年，我们研究了（1）搜索VPS9P的结合因子，Rab5特异性GFEF，（2）PIK1P/RAB11/GGAS激活RAB5的机制，以及（3）搜索独立于ARF1P的RAB5激活的因素。在（1）中，我们尝试使用GST-VPS9P作为诱饵将VPS9P结合因子从芽酵母的蛋白质提取物中分离出来。首先，引入了一个实验系统，以表达和净化大肠杆菌重组的GST-VPS9P，并完成。随后，使用获得的GST-VPS9P通过下拉方法纯化结合蛋白。目前，与GST的下拉部分相比，SDS-PAGE上的GST-VPS9P在SDS-PAGE上尚未获得特定的频段。明年，我们将努力改善纯化方法。在（2）中，仅三个因素或组合生成功能不足菌株，并分析了RAB5同源物vps21p的激活水平。结果，可以发现，与野生应变相比，单独的PIK1P功能不足的功能不足，其激活水平为80％或更高，仅此而已。下一个。当组合分析多个功能性缺乏菌株时，发现PIK1/RAB11的菌株降低了约60％，PIK1/RAB11/GGA的菌株降低了约10％。对其他组合进行了同样的研究，并揭示了PIK1，RAB11和GGA与RAB5激活独立参与。这些发现已提交给学术论文，目前正在同行审查。在（3）中，我们集中于以下事实：在内体传输前后，蛋白质定位于高尔基/TGN引起异常的内溶性转运，并用ARF1产生了双缺陷株，并分析了GFP-VPS21p对内体转运的效果。