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トランスゴルジネットワーク上で制御される新規なエンドソーム形成機構の解明

阐明跨高尔基体网络调节的新型内体形成机制

基本信息

批准号：
21K06157
负责人：
長野真
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、(1) Rab5特異的なGFEFであるVps9pの結合因子の探索、(2) Pik1p/Rab11/GGAsによるRab5活性化のメカニズム、および(3) Arf1pと独立してRab5の活性化を制御する因子の探索を進めた。(1)では、GST-Vps9pをbaitとして、出芽酵母のタンパク質抽出液からVps9p結合因子の単離を試みた。まず、大腸菌リコンビナントでGST-Vps9pを発現・精製する実験系を導入し、完了した。続いて、得られたGST-Vps9p用いて、プルダウン法で結合タンパク質の精製を行った。現在のところ、コントロールとしておいたGSTのプルダウンフラクションと比較して、SDS-PAGE上、GST-Vps9pで特異的なバンドは得られていない。次年度は、精製法の改善を図る。(2)では、3つの因子について、単独あるいは複数組み合わせで、機能欠損株を作製し、Rab5ホモログVps21pの活性化レベルを解析した。この結果、Pik1p単独の機能欠損株では、野生株と比較して80%以上の活性化レベルであり、単独では大きな影響を与えないことを明らかとした。次に。複数組み合わせて機能欠損株を解析したところ、Pik1/Rab11の機能欠損株で60%程度、Pik1/Rab11/GGAsの機能欠損株で10%まで低下することを見出した。これら以外の組み合わせでも同様に検討し、Pik1、Rab11、GGAsがそれぞれ独立してRab5活性化に関与することが明らかとなった。これらの研究結果を含め、学術論文に投稿し、現在査読中である。(3)では、ゴルジ/TGNに局在するタンパク質の中で、その遺伝子欠損によって、エンドソーム輸送前後のステップでエンドーリソソーム輸送が異常となるものに注目し、ARF1との二重欠損株を作製し、GFP-Vps21pのエンドソーム輸送への影響を解析した。

Our は ", (1) Rab5 specific な GFEF である Vps9p のの exploration, combined with factor (2) Pik1p Rab11 / GGAs による Rab5 activeness のメカニズム, および (3) Arf1p と independent して Rab5 の activeness を suppression する factor の explore を into めた. (1) では, GST - Vps9p を bait として, budding yeast のタンパク qualitative extract から Vps9p combination factor の単 from を try みた. Youdaoplaceholder0, escherichia coli リコビナビナトでGST-Vps9pを occurrence · refinement する laboratory を introduction た, completion of た. 続いて, られた GST - Vps9p use いて, プルダウン method combining でタンパク mass line の refined をった. Now のところ, コントロールとしておいた GST のプルダウンフラクションと compare して, sds-page, GST - Vps9p で specific なバンドは have られていない. In the following year, る and the refining method will be improved by を figure る. (2) では, 3 つの factor について, 単 alone あるいは plural groups of み close わせで, function owe damage plant し the を cropping, Rab5 ホモログ Vps21p の activeness レベルを parsing した. この results, Pik1p 単の function alone owe damage strain では, wild strains と comparison して 80% の activeness レベルであり, 単 alone では big きな influence を and えないことを Ming らかとした. Times に. Function of complex number groups み close わせて owe damage strain を parsing したところ, Pik1 / Rab11 の function owe 60% で damage cases, Pik1 Rab11 / GGAs の function owe loss 10% strains でま low ですることを shows した. Outside これらの group み close わせでも with others に beg し検, Pik1, Rab11, GGAs がそれぞれ independent して Rab5 activeness に masato and することが Ming らかとなった. The research results を contain め, academic papers に have been submitted to である, and are now available in 読 for である. (3) では, ゴルジ / TGN に bureau in するタンパク qualitative ので, その heritage 伝 son owe loss によって, エンドソーム before and after delivery のステップでエンドーリソソーム conveying が abnormal となるものに attention し, ARF1 との double owe damage plant し the を cropping, GFP - Vps21p のエンドソーム conveying へのを solution Analyze the た.