メダカ椎間における硬節細胞の多分化能の検証とWntによる未分化性維持機構の解析

青鳉椎间盘骨核细胞多能性验证及Wnt维持不分化机制分析

• 批准号: 21K06245
• 负责人: 猪早 敬二
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06245/
• 关键词: メダカ; 硬節細胞; 骨芽細胞; 細胞分化; 脊椎発生; 多分化能; Wnt

メダカ脊椎の椎間領域(椎間板に相当する組織)は骨成長の場であると共に、硬節に由来する骨芽細胞の前駆細胞が未分化の状態で維持されていると考えられる。これらの硬節由来細胞の未分化性の維持には、Wntファミリーに属する遺伝子、wnt4bが必須であることがメダカ変異体の解析で分かった。本研究では、硬節由来細胞の分化を制御する分子カスケードを明らかにするとともに、椎間域の硬節由来細胞の多分化能の有無についても精査することを目的としている。初年度では、硬節マーカー遺伝子のプロモーター制御下で、Creリコンビナーゼを発現するトランスジェニックメダカ系統を作製し、loxPメダカ（骨芽細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーター制御下で普段はDsRed、Cre存在下でEGFPを発現誘導するトランスジェニック系統）と交配することで、メダカの硬節細胞が骨芽細胞へと分化していることを明らかにした。本年度では、硬節マーカー遺伝子のメダカ変異体の作製を試みた。CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術を用いることで、硬節マーカー遺伝子のメダカ変異体を複数作製し、系統化することに成功した。これらの変異体は、硬節マーカー遺伝子をコードするゲノムDNAに数塩基の挿入や欠失を持つため、フレームシフト型の変異が生じ、硬節マーカー遺伝子の機能に異常が起こることが大いに期待された。次に、これらの変異体の表現型を精査したところ、脊椎の骨芽細胞の発生に異常が見られ、その結果として脊椎骨の形成不全が起こることが明らかとなった。このことは、メダカの硬節細胞が骨芽細胞へと分化するという本研究初年度の研究結果を支持し、さらにメダカの硬節細胞が脊椎骨の形成に関与していることを強く示唆している。

The interbody region of the spine (intervertebral plate equivalent tissue) is the site of bone growth, and the origin of the hard segment is the site of bone bud cells that remain undifferentiated. The undifferentiated nature of these hard node derived cells is maintained in the presence of a gene, a wnt 4b gene, and a protein. The purpose of this study is to investigate the molecular mechanism for regulating differentiation of hard knot-derived cells in the intervertebral space and the presence or absence of multiple differentiation of hard knot-derived cells in the intervertebral space. In the beginning of the year, the hard section of the hard section of the son of the control under the control of the hard section of the hard section of the hard section (Bone bud cells-specific development of EGFP under the control of DsRed, Cre in the presence of EGFP induction system), mating, hard node cells and bone bud cell differentiation. This year, the hard section of the child's work to try to change the system CRISPR/Cas9 is a system for editing information. This is the first time that a DNA gene has been inserted into a DNA gene. In addition, the phenotype of different kinds of bone marrow was examined carefully, and the abnormal development of bone bud cells in vertebrae was observed. The results of this study at the beginning of this study support the relationship between hard ganglion cells and bone bud differentiation, and strongly suggest that hard ganglion cells are involved in the formation of vertebrae.