メダカ椎間における硬節細胞の多分化能の検証とWntによる未分化性維持機構の解析

青鳉椎间盘骨核细胞多能性验证及Wnt维持不分化机制分析

基本信息

批准号：
21K06245
负责人：
猪早敬二
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06245/
关键词：
メダカ硬節細胞骨芽細胞細胞分化脊椎発生多分化能 Wnt

项目摘要

メダカ脊椎の椎間領域(椎間板に相当する組織)は骨成長の場であると共に、硬節に由来する骨芽細胞の前駆細胞が未分化の状態で維持されていると考えられる。これらの硬節由来細胞の未分化性の維持には、Wntファミリーに属する遺伝子、wnt4bが必須であることがメダカ変異体の解析で分かった。本研究では、硬節由来細胞の分化を制御する分子カスケードを明らかにするとともに、椎間域の硬節由来細胞の多分化能の有無についても精査することを目的としている。初年度では、硬節マーカー遺伝子のプロモーター制御下で、Creリコンビナーゼを発現するトランスジェニックメダカ系統を作製し、loxPメダカ（骨芽細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーター制御下で普段はDsRed、Cre存在下でEGFPを発現誘導するトランスジェニック系統）と交配することで、メダカの硬節細胞が骨芽細胞へと分化していることを明らかにした。本年度では、硬節マーカー遺伝子のメダカ変異体の作製を試みた。CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術を用いることで、硬節マーカー遺伝子のメダカ変異体を複数作製し、系統化することに成功した。これらの変異体は、硬節マーカー遺伝子をコードするゲノムDNAに数塩基の挿入や欠失を持つため、フレームシフト型の変異が生じ、硬節マーカー遺伝子の機能に異常が起こることが大いに期待された。次に、これらの変異体の表現型を精査したところ、脊椎の骨芽細胞の発生に異常が見られ、その結果として脊椎骨の形成不全が起こることが明らかとなった。このことは、メダカの硬節細胞が骨芽細胞へと分化するという本研究初年度の研究結果を支持し、さらにメダカの硬節細胞が脊椎骨の形成に関与していることを強く示唆している。

Medaka脊柱（与椎间盘相对应的组织）的椎骨区域是骨骼生长的地方，人们认为从硬节点得出的成骨细胞的祖细胞保持在未分化状态。 Medaka突变体的分析表明，Wnt4b是属于Wnt家族的基因，对于维持这些硬源衍生的细胞的未分化至关重要。这项研究旨在阐明调节硬化胶质细胞分化的分子级联反应，并检查椎间区域中的硬化胶质衍生细胞是否是多磁体。在第一年，我们创建了一条转基因MEDAKA系，在硬节点标记基因的启动子控制下表达CRE重组酶，并与Loxp Medaka配合（一种经常在基因在osteo osteblasts中表达的基因控制的CRE的表达的转基因线（通常诱导CRE的启动子控制下CRE的表达）。今年，我们试图创建一个硬节点标记基因的Medaka突变体。通过使用CRISPR/CAS9系统使用基因组编辑技术，我们成功地创建了硬节点标记基因的多个MEDAKA突变体。这些突变体在编码硬节点标记基因的基因组DNA中具有几个碱基插入或缺失，这导致了移码突变，并且高度期望发生硬节点标记基因功能的异常。接下来，对这些突变体的表型的仔细检查表明，脊柱成骨细胞的发展异常，导致脊柱发育不良。这支持了这项研究第一年的发现，该发现将Medaka硬性细胞分化为成骨细胞，并且还强烈表明Medaka Hard-Node细胞参与了椎骨的形成。