トランスジェニックメダカを用いた脊椎形成突然変異体のスクリーニングとその解析

利用转基因青鳉筛选脊柱形成突变体及其分析

基本信息

批准号：
15770142
负责人：
猪早敬二
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770142/
关键词：
メダカトランスジェニック脊椎突然変異硬節突然変異体

项目摘要

申請者らが開発に成功した、twist遺伝子のプロモーターを用いたGFPトランスジェニックメダカ系統では、生きたまま硬節の挙動を観察することが可能である。twist-GFP陽性細胞は胚発生の過程で、予定椎間板領域の脊索周囲に局在するようになり、その局在は成魚の椎間板の周囲においても継続して観察される。透過型電子顕微鏡を用いて超微細構造学的な解析を行ったところ、twist-GFP陽性細胞は立方体もしくは楕円形で、いずれも粗面小胞体に富んでおり、哺乳類における典型的な骨芽細胞の特徴と一致した。これらの結果は、twist-GFP陽性細胞が椎体形成を担う骨芽細胞であり、椎間板領域が椎体形成の場として機能的であることを示唆している。また、脊椎融合の表現型を示す自然発生突然変異体であるダルマメダカとトランスジェニック系統との交配により、twist-GFPトランスジェニック"ダルマ"メダカを作製したところ、椎体同士の融合が認められる予定椎間板領域において、twist-GFPの発現が欠失していることが明らかとなった。この結果は、硬節細胞の椎間板形成への関与を支持するものであり、twist-GFPトランスジェニック系統を用いて、硬節および脊椎に異常を示す突然変異体の単離を行う本実験方法が有効であることを示した。さらに、化学変異剤ENU(N-エチル-N-ニトロソ尿素)を用いて突然変異を誘発し、脊椎形成に関わる突然変異体の単離を行った。その結果、脊椎の分節性が左右でズレが生じる変異体が2系統、脊椎融合を示す変異体を3系統、単離することに成功した。

在GFP转基因MEDAKA谱系中，使用了申请人成功发展的扭曲基因的启动子，可以观察到硬节点的行为。在胚胎发育过程中，Twist-GFP阳性细胞在计划的椎间盘区域的脊椎周围定位，并且在成年人的椎间盘周围继续观察到它们的定位。使用透射电子显微镜进行超微结构分析，发现扭曲GFP阳性细胞是立方体或椭圆形的，均富含在粗糙的内质网中，与哺乳动物中典型的成骨细胞特征一致。这些结果表明，Twist-GFP阳性细胞是负责椎体形成的成骨细胞，并且椎间盘区域是椎体形成的领域。此外，当Twist-GFP转基因“ Dharma” Medaka是通过在具有转基因线的脊柱融合表型之间交配而产生的，该突变体表现出具有转基因线的脊柱融合表型，揭示了在预期椎体之间融合的圆盘区域中删除了Twist-GFP的表达。这些结果支持硬节点细胞参与椎间盘形成，并证明了使用Twist-GFP转基因线的实验方法可有效分离出强烈节点和脊柱异常的突变体。此外，使用化学突变体ENU（N-乙基-N-硝基库）诱导突变，以分离参与脊柱形成的突变体。结果，我们成功地分离了两个突变体，这些突变体在脊柱的段性中引起差异，以及三个表现出脊柱融合的突变体。