Analysis of medaka intestinal atresia mutant

本研究ではアクトミオシンの制御の異常により胚発生時に腸管閉鎖を生じるメダカの突然変異体を用い、腸管閉鎖症の発症機構の一端を明らかにすることを目的としている。本年度は（１）腸管閉鎖部位における遺伝子発現変動のシングルセルレベルでの解析、（２）腸管閉鎖を生じる際のライブイメージング、のための予備実験を行った。（１）腸管閉鎖に先行して起こる現象として応募者が捉えている最も初期の兆候は、stage25胚における腸管閉鎖部位での異常なアクチンの集積である。この時期に腸管で生じている現象を遺伝子発現のレベルから捉えるために、この時期の腸管を単離しシングルセルレベルでの遺伝子発現解析を行い、変異体における発現変動を明らかにすることを目的としている。しかしながら、この時期の胚はライブの状態では変異体の識別を行うことができず、何らかの手法で変異体を識別する方法が必要である。そのために、組織特異的に蛍光タンパクを発現するコンストラクトを原因遺伝子であるmypt1にノックインし、遺伝子の機能破壊が行われたアリルを持つ個体で組織特異的な蛍光タンパク質の発現が観察される系統の作成を試みた。これまでに心臓特異的にmCherryを発現するノックイン系統を作成している。本年度はこれに加えて心臓にGFPを発現するノックイン系統を作成することを試みた。両ノックイン系統を用いることにより、GFP/mCherryの両者が発現する胚を変異体ホモの個体を判別できることが期待される。（２）これまでに作成したLifeact-mCherryのノックイン個体では、観察に十分な蛍光強度が得られなかったことから、新たにアクチンに結合するnanobodyを利用したコンストラクトを作成し、内在性アクチンの局在を可視化できるか否かについて検討した。

本研究ではアクトミオシンの制御の異常により胚発生時に腸管閉鎖を生じるメダカの突然変異体を用い、腸管閉鎖症の発症機構の一端を明らかにすることを目的としている。本年度は（１）腸管閉鎖部位における遺伝子発現変動のシングルセルレベルでの解析、（２）腸管閉鎖を生じる際のライブイメージング、のための予備実験を行った。（１）腸管閉鎖に先行して起こる現象として応募者が捉えている最も初期の兆候は、stage25胚における腸管閉鎖部位での異常なアクチンの集積である。この時期に腸管で生じている現象を遺伝子発現のレベルから捉えるために、この時期の腸管を単離しシングルセルレベルでの遺伝子発現解析を行い、変異体における発現変動を明らかにすることを目的としている。しかしながら、この時期の胚はライブの状態では変異体の識別を行うことができず、何らかの手法で変異体を識別する方法が必要である。そのために、組織特異的に蛍光タンパクを発現するコンストラクトを原因遺伝子であるmypt1にノックインし、遺伝子の機能破壊が行われたアリルを持つ個体で組織特異的な蛍光タンパク質の発現が観察される系統の作成を試みた。これまでに心臓特異的にmCherryを発現するノックイン系統を作成している。本年度はこれに加えて心臓にGFPを発現するノックイン系統を作成することを試みた。両ノックイン系統を用いることにより、GFP/mCherryの両者が発現する胚を変異体ホモの個体を判別できることが期待される。（２）これまでに作成したLifeact-mCherryのノックイン個体では、観察に十分な蛍光強度が得られなかったことから、新たにアクチンに結合するnanobodyを利用したコンストラクトを作成し、内在性アクチンの局在を可視化できるか否かについて検討した。