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網膜コリン作動性ニューロンで発見された新奇なアセチルコリン合成経路の検討

检查视网膜胆碱能神经元中发现的新型乙酰胆碱合成途径

基本信息

批准号：
20K09836
负责人：
金田誠
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K09836/
关键词：
プリン受容体アセチルコリンコリン retina acetylcholine purinoceptor

项目摘要

P2X2-RとGFPを強制発現させたHEK細胞を、コリン溶液中でインキュベートし、ATPを添加するとコリン取り込みが増加することはHPLCを用いた実験で確認済みである（Ishii …Kaneda 2017 J. Neurophysiol.）。令和３年度までに実施した研究で、ACh合成能を高めたHEK細胞株では、高濃度コリン溶液中でP2X2-Rを強制発現させたHEK細胞にATPを作用させると、流入したコリンからAChが産生されることはHPLC法で確認することが出来た。そこでACh合成能を高めるなどの遺伝子操作を加えていない通常のHEK細胞を用いて、同様の検討を進めた。通常のHEK細胞を用いた検討では、できるだけ生理的条件に近い状況でAChの合成が起こるかどうかを検討する目的で、細胞外液中のコリン濃度を下げた生理的濃度のコリンを含む溶液中でも実験を行った。その結果、生理的濃度のコリン溶液中では、通常のHEK細胞を用いてATP投与時にみられるACh合成量の増加をHPLCで検出することは難しいと判断せざるを得ない結果が得られた。令和４年度は、ACh合成能を高めたHEK細胞株を使って、生理的濃度のコリン溶液中でATP刺激で細胞内に流入したコリンからのACh合成量を計測する実験を実施した。その結果、生理的濃度のコリン溶液中でもATPを作用させることで、P2X2-Rを通じてコリンが細胞内に流入し、その結果AChの合成が増加することが証明できた。また論文化に必要な様々な基礎的な追加実験を実施した。ここまでの研究成果を日本生理学会、日本神経科学学会の年次大会で報告し、その成果をまとめて投稿した。

P2X2-R and GFP stress are detected in HEK cells, and ATP is added to HEK cells to confirm the presence of P2 X2-R in HEK cells (Ishii …Kaneda 2017 J. Neurophysiology.). In the third year of this study, the synthesis of ACh in HEK cells was confirmed by HPLC. The synthesis of ACh can be improved by increasing the use of HEK cells and discussing the same. Usually HEK cells are used under physiological conditions, and the synthesis of ACh is initiated under physiological conditions. The concentration of ACh in extracellular fluid is reduced to physiological concentration. The results showed that the physiological concentration in the solution was higher than that in the normal HEK cells. When ATP was added, the amount of ACh synthesized was increased. The HPLC results showed that it was difficult to determine the concentration of ACh in the solution. In order to increase ACh synthesis in HEK cell lines in 2010 and 2014, ATP stimulated intracellular influx and ACh synthesis in physiological concentrations were measured. As a result, the physiological concentration of ATP in the solution was increased, and the intracellular influx of P2X2-R was increased. On the basis of cultural necessity, the additional measures are implemented. The results of this research were presented at the annual general meeting of the Japanese Physiological Society and the Japanese Society of Neuroscience.