皮膚障害発現機序の解明によるボリコナゾールの至適投与設計法の開発

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令和4年度は、前年度までに行っていたケラチノサイトを用いたVRCZ、VNO、P-VNOおよびPD-VNO添加による細胞障害性についての評価の検討を進めた。前年度までの課題としては、細胞実験において設定した条件で、P-VNOとPD-VNOの細胞障害性が真に同程度か否か判別できていないことが課題であった。課題解決のため、前回実験で得られた各条件下の残液をLC-MS/MSにより測定を行うこととした。結果としては、P-VNOを想定した条件下の残液中にはPD-VNOが含まれていることが確認され、細胞実験の条件見直しの必要性が考えられた。条件は現在検討中であるが、以下の条件にて再試験を行う予定である。正常ヒト表皮角化細胞(NHEKs) を、 HuMedia-KG2 (KG2) 培地を用いて96穴マイクロプレートに播種。NHEKsは濃度既知のVNOを含有するKB2培地に交換した後、UVB照射、熱処理の条件を設定し、P-VNOおよびPD-VNOの産生を想定した場合分けを行う。この熱処理条件設定の際に、前回までは熱処理しない群は常温下の条件であったが、これを氷冷上とすることによりP-VNOからPD-VNOへの変換を制御する。その後、それぞれに8J/cm2のUVAを曝露。なお、UVA未曝露群は、アルミ箔にてカバーすることで UVAを完全に遮蔽。UVA曝露後、33μg/mL neutral red (NR) 含有 KB2培地にて2時間培養した後、30%エタノール含有0.1 mol/L HCl溶液を用いてNRを抽出。細胞数の指標は、抽出液の吸光度を測定し、試験試料未処理細胞 (N.C.) を100とした場合の相対値で表す。