クライオ電子線トモグラフィーによる脂質交換輸送ゾーンの形態・機能解析

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昨年度樹立した安定発現細胞株を用いて、まずイメージング解析により脂質交換輸送ゾーンを詳細に解析し、脂質交換輸送ゾーンには極めて動的な状態のものと、比較的動きの少ない安定的なものが存在することが明らかになった。また、脂質交換輸送ゾーンにおいて共局在する脂質輸送タンパク質と、そうでない脂質輸送タンパク質とが存在することも判明した。さらに、脂質輸送タンパク質の機能欠損による脂質交換輸送ゾーンへの影響を解析したところ、脂質交換輸送ゾーン形成に大きく影響するものとそうでないものが存在していた。また、本年度も海外渡航規制のために、クライオ電子線トモグラフィー解析による超微細構造の解析を、海外において行うことができなかった。そこで、前年から着手している通常の電子顕微鏡を用いた微細構造の解析を進めた。パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合液を用いた化学固定が最も固定状況が良好であったため、この方法を選択した。その後の工程は定法にしたがって電子顕微鏡解析のためのサンプル調整を行った。あらかじめGFP融合タンパク質として低レベルに発現させることで脂質交換輸送ゾーンを可視化しておき、これを共焦点顕微鏡により観察・データ取得を行い、電子顕微鏡観察の対象領域を事前に決定した。GFP蛍光が存在する細胞膜領域近辺に網目状の小胞体が接する領域を電子顕微鏡観察により捉えることができた。その領域を目印に、電子顕微鏡データの取得を行った。現在、複数の細胞における脂質交換輸送ゾーンの電子顕微鏡像の取得に成功している。