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クライオ電子線トモグラフィーによる脂質交換輸送ゾーンの形態・機能解析

冷冻电子断层扫描脂质交换运输区的形态和功能分析

基本信息

批准号：
20KK0159
负责人：
中津史
金额：
$ 11.98万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-10-27 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度樹立した安定発現細胞株を用いて、まずイメージング解析により脂質交換輸送ゾーンを詳細に解析し、脂質交換輸送ゾーンには極めて動的な状態のものと、比較的動きの少ない安定的なものが存在することが明らかになった。また、脂質交換輸送ゾーンにおいて共局在する脂質輸送タンパク質と、そうでない脂質輸送タンパク質とが存在することも判明した。さらに、脂質輸送タンパク質の機能欠損による脂質交換輸送ゾーンへの影響を解析したところ、脂質交換輸送ゾーン形成に大きく影響するものとそうでないものが存在していた。また、本年度も海外渡航規制のために、クライオ電子線トモグラフィー解析による超微細構造の解析を、海外において行うことができなかった。そこで、前年から着手している通常の電子顕微鏡を用いた微細構造の解析を進めた。パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合液を用いた化学固定が最も固定状況が良好であったため、この方法を選択した。その後の工程は定法にしたがって電子顕微鏡解析のためのサンプル調整を行った。あらかじめGFP融合タンパク質として低レベルに発現させることで脂質交換輸送ゾーンを可視化しておき、これを共焦点顕微鏡により観察・データ取得を行い、電子顕微鏡観察の対象領域を事前に決定した。GFP蛍光が存在する細胞膜領域近辺に網目状の小胞体が接する領域を電子顕微鏡観察により捉えることができた。その領域を目印に、電子顕微鏡データの取得を行った。現在、複数の細胞における脂質交換輸送ゾーンの電子顕微鏡像の取得に成功している。

In the past year, stable cell lines were established and analyzed in detail, and lipid exchange and transport conditions were analyzed in detail. Lipid exchange and transport is a common phenomenon. In addition, the lipid exchange and transport mechanism has been analyzed and analyzed in order to improve the lipid transport mechanism. This year, overseas navigation regulations were adopted, and electronic lines were used to analyze ultra-fine structures. The analysis of fine structures by ordinary electron micromirrors has been carried out since the beginning of the year. The best fixation condition was obtained by chemical fixation of the mixture. After the project, the method of electron microscope analysis was determined. The GFP fusion protein was detected by confocal microscopy, and the target area was determined beforehand. GFP light is present in the cell membrane near the mesh-like small cells, and the field is observed by electron microscopy. The field of vision printing, electronic micro-mirror acquisition Now, a number of cellular lipid exchange and transport systems have been successfully obtained.