病原菌ヘムトランスポーターの構造変化の追跡と基質輸送機構の解明

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病原菌は宿主に感染した際に、血液ヘモグロビンから鉄をヘムの形で奪い取り、増殖に必要な栄養素として利用している。そのため、ヘムの取り込みは感染症を抑制する上でも注目されてきた。本課題では、グラム陰性の病原性細菌でアデノシン三リン酸（ATP）依存的にペリプラズム空間から細胞質へとヘムの膜輸送を行うABC型ヘムトランスポーターの構造変化のメカニズムを明らかにすることを目指している。これまでの当グループによる研究で明らかにした結晶構造からは、分子の中心を通る基質輸送チャネルに大きな構造変化が起こることが示唆されたが、ヘムやATPが結合した状態での構造は未だに決定できていないせいもあり、メカニズムの理解が全く進んでいない。本年度は、前年度に引き続きクライオ電子顕微鏡によって、ヘムの輸送過程の各構造のスナップショットを取得することを目指した。界面活性剤や両親媒性ポリマーなどの可溶化剤の種類を含めて精製方法の検討を進めた結果、観察グリッド上でのタンパク質粒子の分散性が向上する条件を見出した。休止状態のアポ型とATPアナログ結合型について、クライオ電子顕微鏡による画像データの収集と3次元画像解析による構造決定を行なった。さらに、ABCトランスポーターのなかでバクテリアのヘムトランスポーターと同じサブファミリー（タイプIIインポーター）に分類されるFe/Mnイオントランスポーターについても大腸菌を利用した組み換え体の発現系構築を行なった。各サブユニットの遺伝子の配置やタグの種類・位置などのプラスミドデザインや培養の際の様々な条件を変えて発現スクリーニングを行ったうえで小スケールでの精製を実施した。