Elucidation of the mechanism of amyloid fibrillation of alpha-synuclein starting from liquid-liquid phase separation

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αシヌクレインのアミロイド線維化は、神経変性疾患の１つであるパーキンソン病の発症と強い相関がある。このタンパク質は神経細胞内でユビキチン化されるが、最近の研究から、ユビキチン化αシヌクレインが液-液相分離し、それが軸索輸送と呼ばれる神経細胞の流れによってアミロイド線維化することが示唆された。しかし、この一連の過程の詳細、とくに構造変化や凝集状態の変化などはよく分かっていない。そこで本研究では、神経細胞内で実際に起こっているαシヌクレインのユビキチン化と軸索輸送（流れ）を試験管内に再現し、それを原子・分子レベルで解析することによって、αシヌクレインの液-液相分離とアミロイド線維化の機構を解明する。加えて、細胞実験により、どのような凝集状態が細胞毒性を示すのかを明らかにする。なお、流れの存在下における原子レベルの解析には、申請者らが独自に開発したRheo-NMRを用いる。本年度はαシヌクレインの発現・精製のプロトコルを見直して、収量を上げることを試みた。タグなしのαシヌクレインを大腸菌発現系で発現し、細胞破砕液の上清を酸性にすることによって不要な夾雑物を沈殿させる戦略をとった。実際にはこの後にイオン交換クロマトグラフィーも行ったが、大幅に精製αシヌクレインの収量を上げることに成功した。得られたαシヌクレインに種々の濃度でPEGを添加し、液-液相分離する条件を検討した。先行研究ではリン酸バッファーやトリスバッファーで液-液相分離する条件が調べられていたが、申請者らは過去にαシヌクレインのRheo-NMR測定でMOPSを用いたため、この実験ではMOPSで液-液相分離することを確認した。また、液-液相分離する条件で各種３次元NMR測定を行った。