Verification of the subfunctionalization hypothesis in paralogous genes by engrafting cis-regulatory elements

通过植入顺式调控元件验证旁系同源基因的亚功能化假说

基本信息

批准号：
21H02543
负责人：
隅山健太
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Nagoya University (2022-2023)Institute of Physical and Chemical Research (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

2022年度はDlx3-4遺伝子クラスターおよびDlx5-6遺伝子クラスターの構造の類似性に注目し、CTCFによる長距離ゲノム領域間でのループ形成などによって物理的にプロモーターと近くなる領域のクラスター間での構造的類似性および鰓弓でのエンハンサー活性の強さから、Dlx3-4遺伝子クラスターではTAD3鰓弓エンハンサー、Dlx5-6遺伝子クラスターでは新規の鰓弓のエンハンサーをそれぞれターゲットとして選定し、エンハンサーノックアウトマウスをCRISPR/Cas9で作製し系統化した。このマウスを用いて、正確にエンハンサー欠失の発現量変化を定量できるAccu-cis法を用いてRNA-seq結果から鰓弓発現に及ぼすその影響を評価した。Dlx56鰓弓エンハンサー欠失マウスでは下顎が上顎化する顕著な表現型が観察された。このマウスの表現型をパラログ活性化でレスキューすることが可能かどうかを確認するため、Dlx56鰓弓エンハンサーをDlx3-4遺伝子クラスターにノックインしたマウスを作成し、交配によりその解析を進めているところである。また、Dlx3-4遺伝子の鋤鼻器エンハンサーをクラスターとして欠失することで効率よく鋤鼻器組織特異的なノックダウンを実現できることが示され、新たな条件付きノックアウトマウス作成の方法論へとつながる成果となった。特に、通常ノックアウトで致死的な表現型を示す遺伝子の場合に、この方法により致死性を回避しつつ特定器官での遺伝子機能解析が可能になる新たな実験系として期待し検証を進めている。

In 2022, we focused on the similarity of the structure of the Dlx3-4 gene cluster and the Dlx5-6 gene cluster, and based on the structural similarity between clusters of regions that physically approach the promoter due to loop formation between long-range genomic regions due to CTCF and the strength of enhancer activity in the gill arch, we selected the TAD3 gill arch enhancer for the Dlx3-4使用CRISPR/CAS9生产并系统化了DLX5-6基因簇的基因簇和新的Gill Arch增强剂和增强子基因敲除小鼠。使用此鼠标，使用ACCU-CIS方法从RNA-Seq结果中评估了对Gill Arch表达的影响，该方法可以准确地量化增强子缺失表达的变化。在缺失DLX56 g弓增强剂的小鼠中观察到了突出的表型。为了确认该小鼠表型是否可以通过旁系同源物激活来挽救，正在与将DLX56吉尔弓增强剂撞到DLX3-4基因簇中，并正在通过交配进行分析。此外，结果表明，删除DLX3-4基因的vonasal增强子作为群集可以有效地实现特定于vonasal组织的敲低，从而导致新的方法论创建条件敲除小鼠。特别是，我们正在进行验证，希望这种方法能够在通常表现出致命表型的基因的情况下允许特定器官中的基因功能分析，同时避免致死性。