Elucidation of Molecular Sorting Mechanisms using Cryo-electron microscopy

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緑藻Chlamydomonasを用いて繊毛タンパク質動態およびチューブリンの翻訳後修飾について2つの成果を得た。１．　pHショックによる鞭毛喪失後の鞭毛再構築過程で、鞭毛タンパク質を積極的に合成することを明らかにした。従来、新規合成鞭毛タンパク質の追跡には放射性同位体が用いられていたが、本研究では、抗生物質puromycinを新規合成ペプチドに取り込むことを利用した、非放射性のSUnSET法を開発した。SUnSET法を用いることで、Chlamydomonasにおける鞭毛への新規タンパク質取り込みを可視化する強力なツールが得られた。2. α-チューブリンとβ-チューブリンはC末端にグルタミン酸リッチな非構造領域（CTT）を持ち、その機能はまだ明らかでないが、繊毛の運動に影響を与える翻訳後修飾の部位として働いている。Chlamydomonasは、同一のタンパク質をコードする2つのα-チューブリン遺伝子と2つのβ-チューブリン遺伝子のみを持っている。この単純な遺伝子構造により、野生型チューブリンを変異型に完全に置き換えることが可能になる。本研究で、CRISPR/Cas9を用いて、CTTが修飾されたチューブリンを発現する変異株を作成した。α-チューブリンのCTTの4つのグルタミン酸残基がアラニンに置換された変異株では、ポリグルタミル化チューブリンがほぼ消失し、麻痺した繊毛を示した。対照的に、β-チューブリンのCTTのグルタミン酸リッチ領域を欠いた変異株は、中心装置を欠いた短い繊毛を形成した。この表現型は、β-チューブリンのCTTに依存するカタニンサブユニットの変異株と類似している。この研究により、α-およびβ-チューブリンのCTTが繊毛の形成と機能において異なる重要な役割を果たしていることが明らかになった。