In-vivo sub-cellular thermometry for quantitative thermal biology

①広視野・３次元・高速化技術・局所加熱技術の実装：今年度、これまで構築してきた広視野蛍光ナノダイヤモンドスピン測定を温度測定に実際に実装し、温度イメージングを可能とした。カメラの露光時間や読み出し速度の最適化作業を重ね、温度精度１℃程度での測定に成功している。また、測定中に焦点がずれる問題に関しても、自動焦点機能を取り込ませることに成功し、例えば、100倍の油浸対物レンズで焦点が10um程度シフトしても追尾することが可能となった。局所加熱に関しても、生きた線虫をライブ映像で確認しながら、狙った点に近赤外レーザーをピンポイント照射することができるようになった。②線虫へのナノ粒子導入：前年度までに、線虫内への蛍光ナノダイヤモンド滞留を成功させている。この滞留現象をより詳細に調べたところ、表面電荷の影響で滞留の程度が大きく変わることが明らかとなった。ナノ粒子の滞留と毒性などの関係についても詳細に検討し、ナノ粒子の表面電荷が線虫のナノ粒子取り込み機能に対して与える影響を解明した（論文執筆中）。本研究の目的である温度測定にとって、最適なナノ粒子ラベリング条件を決定する上で重要な知見である。③線虫のカルシウムイメージング：本研究では、線虫の局部精密加熱と神経活動の相関を得ることを目指している。神経活動の測定のために、カルシウム指示性のあるGCaMPを発現した遺伝子組換え線虫の実験を開始した。複数の遺伝子組換え株を導入しているが、株によって培養条件が若干異なるため、カルシウムイメージングを実施するに当たっての条件検討を重ねている。④オミクス解析への検討：本研究では、局所温度刺激を加えた際に生じる線虫のオミクス解析を行う。そのために、代謝物測定（メタボロミクス）に着目し、質量分析による測定を行うことに決定した。国際共同研究によるパートナーを見つけ、次年度測定する段階まで到達した。

①広視野・３次元・高速化技術・局所加熱技術の実装：今年度、これまで構築してきた広視野蛍光ナノダイヤモンドスピン測定を温度測定に実際に実装し、温度イメージングを可能とした。カメラの露光時間や読み出し速度の最適化作業を重ね、温度精度１℃程度での測定に成功している。また、測定中に焦点がずれる問題に関しても、自動焦点機能を取り込ませることに成功し、例えば、100倍の油浸対物レンズで焦点が10um程度シフトしても追尾することが可能となった。局所加熱に関しても、生きた線虫をライブ映像で確認しながら、狙った点に近赤外レーザーをピンポイント照射することができるようになった。②線虫へのナノ粒子導入：前年度までに、線虫内への蛍光ナノダイヤモンド滞留を成功させている。この滞留現象をより詳細に調べたところ、表面電荷の影響で滞留の程度が大きく変わることが明らかとなった。ナノ粒子の滞留と毒性などの関係についても詳細に検討し、ナノ粒子の表面電荷が線虫のナノ粒子取り込み機能に対して与える影響を解明した（論文執筆中）。本研究の目的である温度測定にとって、最適なナノ粒子ラベリング条件を決定する上で重要な知見である。③線虫のカルシウムイメージング：本研究では、線虫の局部精密加熱と神経活動の相関を得ることを目指している。神経活動の測定のために、カルシウム指示性のあるGCaMPを発現した遺伝子組換え線虫の実験を開始した。複数の遺伝子組換え株を導入しているが、株によって培養条件が若干異なるため、カルシウムイメージングを実施するに当たっての条件検討を重ねている。④オミクス解析への検討：本研究では、局所温度刺激を加えた際に生じる線虫のオミクス解析を行う。そのために、代謝物測定（メタボロミクス）に着目し、質量分析による測定を行うことに決定した。国際共同研究によるパートナーを見つけ、次年度測定する段階まで到達した。